EB的染色原理及其相关讨论.ppt

基因分子生物学实验 EB的染色原理和相关 问题讨论 罗 睿 北京协和医学院 4.参考文献 1.EB的概述 2.EB与核酸的 作用原理 主要 内容 3.相关问题讨论 1. 化学结构 分子式：C21H20BrN3 英文名：Ethidium bromide 分子量：394.3139 g/mol 熔 点：260-262 °C 外 观：紫红色固体 　　 为芳香族荧光化合物 2. 理化特点 一种高度灵敏的嵌入性荧光染色剂。用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸。 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridinium bromide溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭 1.EB的基本信息 在紫外光的照射下，未与核酸结合的溴化乙锭可被激发出橙红色萤光。 在与DNA或双股RNA结合时，萤光强度会增强20倍，使得核酸电泳后的胶片可以辨识核酸的相对位置。在核酸分子中，EB分子插入到两层碱基对之间。 溴化乙锭（EtBr，EB） 是一种核酸染料，常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸染色。 是一种强的诱变剂，可能也是一种致癌物或致畸剂。 激发荧光的能量来源于两个方面： 1.核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭； 2.结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量。 溴化乙锭(EB)是一种荧光染料 这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测 来源于这两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光，发射波长为605nm。 2.EB与核酸的作用原理 1）.溴化乙锭EB在琼脂糖凝胶电泳中先加与 后加的区别？ 3.相关问题讨论 问题1 先加EB，染色与电泳同时进行： a. 加在胶里总体积小，所以比较方便节省； b. 会导致胶的整体背景稍微高些，比较暗； c. 长时间、长距离的电泳先加EB的话，信号强度会相应下降； d. 不宜用于核酸分子大小的确定和定量。 后加EB，染色在电泳完成后： a．可以减少污染，无背景色，图较漂亮； b. 相对浪费时间。 原因分析： EB带正电荷，中和核酸分子的负电荷，同时由于的他的嵌入增加了核酸分子的刚性，使迁移速率减慢，故不宜用于凝胶电泳测定核酸分子的大小。 另外，由于在凝胶中，游离的EB分子向负极泳动，会使样品中前后各带染色不均匀，影响定量。 2）.EB废物的如何处理？ 问题2 EB废物的处理如下： (1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： 　　a. 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； 　　b. 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的25 mol/L HCl，混匀， 置室温数小时； 　　c. 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 　　 (2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： 　　a. 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时； 　　b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。如果你只是手接触了用EB污染的东西,用肥皂水洗一下就没事了。一定要带手套操作有EB污染的实验。EB有很强的诱变剂，操作时一定要慎重。 Borst P. Ethidium DNA agarose gel electrophoresis: how it started. IUBMB Life. 2005 维基百科 小木虫 丁香园 《核酸与溴化乙锭相互作用的光谱研究》 孙艳涛、白雨萍等 《分子克隆实验指南-第三版》 4.参考文献 Thank you！ 基因分子生物学实验2012