DNA的重组载体蓝背景.pptVIP

重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr f1-ori pBluescript PT3 噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的 转录，提取出来的单链DNA重组分子 在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可 实现外源基因的体外转录。 2.1.5人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体 那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上 构建的，命名为pBACs，其装载量范围在50 - 300 kb之间。各 种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 2.1.1.2质粒的构建 原因：天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大 多是由少数几个野生型质粒构建而成的： pSC101 8.8 kb，拷贝数 5，四环素抗性标记基因 Tcr ColE1 6.5 kb，拷贝数 20 - 30，大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因 Apr 改造的原则 （1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的相对分子质量 （2）灭活某些质粒的编码基因，应为非转移性质粒，应为松弛型质粒 （3）加入易于识别的选择标记基因 （4）引入具有多种限制性内切酶的单一识别位点 （5）根据外源基因克隆的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件 构建过程（P14） 2.1.1.3质粒的分类 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因 低拷贝质粒 来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因 温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头（polylinker） 整合质粒 装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆 表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件 探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选 重要的大肠杆菌质粒载体 松弛型复制 pBR322： 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆 pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell 用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 重要的大肠杆菌质粒载体 pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理 pUC18/19 Plac lacZ’ MCS b-半乳糖苷酶的a-肽段 a b 5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 X-gal 重要的大肠杆菌质粒载体 pGEM-3Z： 多拷贝 装有两个噬菌体的强启动子 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 2743 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr pGEM-3E PSP6 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等 2.1.1.4质粒DNA的分离纯化 实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 碱溶法 质粒DNA纯度底、快速、操作简便 沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间 氯化铯密度梯度离心法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 加CsCl和溴乙锭； 超速离心过夜； 在紫外灯下吸取cccDNA； 稀释沉淀cccDNA。 proteins ocDNA