mpn法测定大肠杆菌.pptVIP

MPN法测定大肠杆菌 一、?材料 1、牛乳样品 2、阳性对照菌 3、 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤、 煌绿乳糖胆盐（BGLB ）肉汤、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH ) 、 1mol/L 盐酸（HCI) 。 试验流程 ? 1、样品的稀释 （1） 固体和半固体样品 称取25g 样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000r/min-10000r/min 均质1 min-2 min ，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。 （2） 液体样品 以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。 （3） 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。 （4） 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 ?（5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。 ? 2、初发酵试验 每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）, 36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。 记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 3、复发酵试验 用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃ 培养48h±2h ，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 4、大肠菌群最可能数（MPN ）的报告 ?根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录B ) ，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN 值。 注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。  * * 3、?仪器设备 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。