PCR原理及其 操作.pptVIP

3.dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系： dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低 4.模板（靶基因target gene） 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一； 传统DNA纯化方法：采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本； SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合 而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇 或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。 临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增； RNA模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止 RNase降解RNA