第二章基因工程基本技术原理-DNA序列分析.pptVIP

第五节 DNA核酸序列分析 目的与要求 2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 引物—延伸测序策略 2.5.1 .1 Sanger双脱氧链终止法原理 酶、原料比例 2.5.1.2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法 克服缺点的一种途径—DNA分子克隆 M13载体克隆DNA片段 使用M13载体系列的优点 2.5.1.3 Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法 Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法基本步骤 2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法 2.5.2.1 Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理 碱基特异的化学切割反应——肼（NH2·NH2） 碱基特异的化学切割反应——硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］ 2.5.2.2 化学修饰法测序图解 2.5.2.3 Maxam－Gilbert化学修饰法优点 2.5.4 DNA杂交测序 杂交的检测 杂交测序的应用 2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题 “测序”思考回答问题 返回目录 检测单碱基的变化 序列比较分析 基因的表达状况 验证其他测序 返回目录 运作方式 存在的问题 大公司“垄断” 仪器公司“垄断” 发展趋势 第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定 西北师范大学 精品课程 武国凡 基因工程 第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定 西北师范大学 精品课程 武国凡 基因工程 理论上，60年代末就已掌握了充分的知识，有可能提前发展出目前的快速DNA序列分析法。只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。1965，Cornall大学以S．W．Holle，为首的科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。事实上，早期发展出来的DNA序列分析法，都是与在RNA序列分析中所用的方法有异曲同工之妙。但这些方法对于DNA的序列测定并不适用。后来在DNA序列测定技术上出现的突破是在创新性的研究思路指导下取得的。 1977，，剑桥分子生物学实验室的生物化学家F．Sanger 用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物，有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。 基本原理 利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2’，3’双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。 在同一反应试管中，同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、ddTTP、以及 dTTP、dATP、dGTP、dCTP（有一种带放射性标记，温育，产生不同长度DNA片段混合物。具有同样的5’一末端，并在3’一末端的ddTTP处终止。 混合物经变性胶电泳分离，获得一系列全部以3’一末端ddTTP为终止残基的DNA片段的电泳谱带模式。 使用相应于其它核酸的抑制物，如ddATP、ddGTP和 ddCTP，并分别在不同反应试管中温育，然后连同第一个 ddTTP反应，平行加到同一变性凝胶上作电泳分离。最后再通过放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。结果就可以从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。 引物合成DNA序列测定的各种方法的共同特点及缺陷 高分子量DNA分子通过核酸内切限制酶的消化作用，降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。然而，为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种（有时往往是数种）其它的核酸内切限制酶，对同种大分子量的DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。费时费钱，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分显王朝。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。 即将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到一种合适的载体分子上。使用这样的克隆程序的本身，就可以保证所有来自同一个重组休克隆的后代，都含有一种同源的插入序列。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为载体进行克隆，所形成的重组体噬菌体也将含有单链形式的DNA插入序列。因此，这样的重组体噬菌体的DNA分子，便可直接用作引物合成反应中的单链模板。序列测定反应中所必须的另一种基本成分——引物，一般是化学合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一