口腔-实验1-分光光度和蛋白测定-田海滨.pptVIP

掌握分光光度法原理 掌握双缩脲法、BCA法和考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量的原理和操作 熟悉标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用 1760年，Lambert从实验中找到了吸光度A与液层厚度L的关系式： A = k1L k1为与被测物性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度和温度有关的常数 双缩脲（Biuret）法测定蛋白质含量 BCA法测定蛋白质含量 考马斯亮蓝法（Bradford)测定蛋白质含量 【原理】 BCA(bicinchoninic acid) 即二喹啉甲酸，是目前比较理想的蛋白质定量方法。在碱性条件下，蛋白的肽键结构将Cu2+还原为Cu1+ , Cu1+与BCA试剂形成稳定的紫色络合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。 2.配置BCA工作液：依据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50:1配置适量BCA工作液，并充分混匀。 注：配置BCA工作液前请将试剂A摇晃混匀。 3. 标准品及样品的测定 （1）分别取25ul上表中新鲜配置的BSA标准液和待测样品，加入到微孔板中。 （2）每孔中加入200ul BCA工作液，并充分混匀。 （3）加盖，37℃孵育30min后冷却至室温或室温放置2h。 （4）以I号管调零点，于562nm处测定各管吸光度。 （5