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设计PCR引物： 正向： 5’-TACTTCCAATCCAATGCA + 目的匹配序列-3’ HHHHHHHHHHHHHHHHHH 反向： 5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTA + 互补配对序列-3’ HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH Ligation-independent cloning 汪文捷 2011.12.19 经典的克隆方法 经典的克隆方法，主要分为以下两种：(1)粘性末端连接，即载体质粒和待插入的外源片段都通过合适的限制性内切酶切割，产生相互匹配的粘性末端，然后在连接酶作用下重新形成磷酸二酯键而得到环化的重组质粒；(2)平末端连接，平末端连接中，载体和片段均为平端，都没有粘性末端突出。 优点：依赖连接酶的克隆方法简单高效，是克隆单个基因的常用的方法。 不足：一方面，插入片段要经过限制性内切酶处理，这样在实验设计时就要考虑目的基因的DNA序列，不能实现多基因的平行操作，不适合高通量；另一方面，该过程使用连接酶，不但延长了实验的周期，而且也会带来载体自连背景，增加了筛选工作量。 PCR 双酶切 双酶切 连接 ligation-independent cloning 在很多情况下，重组DNA技术的应用都会受到基因序列中原有的酶切位点的限制，尤其是多基因片段的重组往往更容易受到限制酶酶切位点序列的限制，研究者不得不使用一些非常稀有的酶切位点或者采用其它的DNA重组方法，大大增加了DNA重组的工作量和难度。因此，开发一种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显得十分重要。 Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的不依赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC)充分满足了上述要求。这种方式不仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点，而且操作简便、方法快捷及连接效率高，应用日益广泛。 在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特定的dNTP存在的缓冲液条件下反应，插入片段能产生10~15个碱基的粘性末端(Aslanidis and de Jong,1990)。载体和PCR片段依靠长的粘性末端重组，此过程不需要连接酶。这种克隆方法不需要考虑插入片段的序列，任何基因都能被克隆到该载体中。而且，整个流程简单到不需要任何限制性内切酶和连接酶，两者在体外条件下孵化，互补的粘性末端退火形成环状分子，经转化进大肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突出和缺口而得到正确重组子(如图)。 刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/.2011.30.0013) LIC方法的特点 LIC方法依赖于T4 DNA Polymerase的核酸外切酶活性，这样就要求被处理的线性载体和片段的末端仅含有3种碱基，这样才可以有效控制反应以产生特定大小的粘性末端。要求载体有较固定的粘性末端，且对于如何使载体线性化有特殊的要求。 LIC方法的优势在于： (1)待克隆的PCR片段不需要限制性内切酶处理。这样就省去了在设计引物时考虑各种酶切位点的麻烦，而且实验过程中可以实行并行操作，对所有的样品进行同样的处理。 (2)速度快。T4 DNA Polymerase所需的时间只要40min，然后75℃热处理20min，载体与目的片段共混孵育10min。相比经典的克隆方法更节约时间。 (3)克隆效率高且操作简便。如前所述，该方法不依赖连接酶，完全是靠粘性末端配对退火，所以不匹配的末端不可能形成双链，载体自连背景低。 (4)相对而言费用较低。该方法中所需要的引物虽然有额外10~15 bp附加碱基，但是相对而言位点特异性重组中所要求的引物是较短的，而且克隆过程中省去了连接酶，也没有使用价格不菲的特殊重组酶。 综合以上几个方面考虑，LIC是一种适合于高通量基因克隆和蛋白质表达的优秀方法。 LIC方法的改进——SLIC 在很多情况下，DNA 片段的克隆和表达，尤其是多基因片段的重组往往会受到限制酶酶切位点序列的限制 ，因此，建立一种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显得十分重要． Li Elledge所建立的不依赖序列和连接的克隆方法(sequence and ligation-independent cloning，SLIC)就能满足上述要求．该方法不受DNA序列的限制，可以将任意序列的多个DNA片段组装到一起，而且不需要连接反应即可完成体外的重组． 该方法的基本原理如下：利用PCR技术在插入片段的两侧分别加上几十bp 的同源末端，参加重组的片段分别在没有dNTP存在的情况下用T4 DNA 聚合酶中的3’-5’外切酶活性22℃ 处理，产生含有同源序列的