医学硕士-吴永琴毕业论文.pptVIP

* 据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约13.8万，每年约有5万人死于宫颈癌，并出现年轻化趋势。可见，对宫颈癌的预防和治疗迫在眉睫。大量研究资料证明[2,3]，生殖道的人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）感染与宫颈癌有着十分密切的关系。 1、宫颈癌在全球女性癌症死亡率中位居第二,每年约有50万宫颈癌新发病例，其中约一半死亡，并出现年轻化趋势。 2、迄今已发现HPV有200多种亚型。研究发现高危型HPV多与宫颈病变和宫颈癌有关，主要包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73型等。在75％以上的宫颈癌中发现的是16、18、31、和45型，其中约50％与 HPV16感染相关，主要导致细胞癌，20％与HPV18相关，主要导致腺癌。 低危型HPV主要包括6、11、34、40、42、43、44型，主要导致非肛门生殖器皮肤疣、口腔和喉乳头瘤以及肛门生殖器尖锐湿疣等，约90％的生殖器疣与HPV6和HPV11有关。 * HPV为双链DNA病毒，属乳多空病毒科乳头瘤病毒属，病毒颗粒直径约55nm，核壳呈20面体对称，有72个壳粒，含近8000个核酸碱基对(bp)，分子量为5×106道尔顿。基因组按功能分为3区：即早期区（E）、晚期区（L）和长控制区（LCR）。E区编码的6个蛋白即E1、E2、E4～E7，在病毒复制和细胞转化中起重要作用；L区由L1和L2组成，Ll高度保守，L2高度可变，反映了HPV抗原的多态性。LCR含有RNA聚合酶所需要的启动RNA合成的核苷酸序列，从而调控基因的表达。HPV感染宿主细胞后病毒核酸整合到宿主细胞内，使宿主细胞发生突变并发展为癌。目前认为，整合后的DNA发生致癌作用的主要基因为E6，E7和E2[3，4]。 HPV E6和E7蛋白是HPV的癌蛋白，在正常组织中少有表达，但在HPV感染引起的宫颈癌细胞和上皮内瘤样变细胞中能稳定并呈高表达，具有特异性的免疫原性，能引发CTL反应，有助于清除肿瘤细胞，是HPV血清学诊断的候选抗原之一，因此，可做为研究HPV的诊断和治疗较为理想的靶抗原[9-11]。研究中受到较多关注的是E7癌蛋白，因为E7相对而言E6表达更多、免疫原性更强且结构更保守[12]。 宫颈癌的复发率较高且治疗费用也高。在美国，每年用于宫颈癌筛查和治疗的费用约为5.7亿美元。目前筛查HPV感染的诊断方法主要依靠检测HPV-DNA的方法如核酸杂交技术HCⅡ[13]等分子生物学技术，这些方法费时长，费用昂贵，不能了解HPV感染的既往史及HPV感染机体的免疫状态，假阳性率高。Peng等[8]用HPV6b VLP检测病人血清阳性率为50%。以HPV VLPS的ELISA方法用于HPV感染的血清学辅助诊断，显示了其具有快速、简便、特异、敏感的特点，尤其适于人群HPV感染的流行病学调查，在血清学诊断及防治病毒感染等方面具有广阔的应用前景。但也存在许多亟待解决、必须面对的问题，如HPV VLPs表达量低，抗原制备难，价格昂贵等。 当前国内外对HPV E7研究多基于真核表达系统[14,15]，操作复杂成本较高，不适宜应用于大规模的人群普查；而原核表达系统具有产量高、操作简便的优点，仍是十分具有吸引力的使用工具。伍欣星等[16]构建原核重组表达载体pWHB-E7，重组蛋白在大肠杆菌中得到表达，约占总菌体蛋白量的30%，主要以包涵体的形式存在，需要对包涵体进行变性、复性等步骤的处理。赖娟等[17]曾构建重组表达载体pET32a(+)/HPV16 E7，重组蛋白主要以可溶状态存在于上清中，为制备血清抗体提供了物质基础。 * 本研究拟运用分子生物学技术，筛选HPV高危型别中发病率位居第二的18型E7基因克隆入原核表达质粒以构建重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7，鉴定后将重组质粒在大肠杆菌内表达HPV 18型E7融合蛋白，表达的目的蛋白经SDS分析和Western blot鉴定，通过ELISA法用纯化的该融合蛋白检测宫颈癌患者血清特异性抗体IgG，对重组蛋白作为特异性诊断抗原的可行性进行评估，从而研究HPV18E7血清学诊断价值，为制备成本低、效率高、适用范围广的诊断抗原奠定实验基础。 1.利用分子生物学技术构建原核表达重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7，经酶切、PCR和测序鉴定后，在大肠杆菌中表达HPV18 E7融合蛋白。 2.制备HPV18 E7融合蛋白诊断抗原，经SDS和Western blot法鉴定后，采用ELISA法用该诊断抗原检测宫颈癌患者血清抗体水平，研究该蛋白的抗原性，为HPV18型感染的诊断研究奠定基础。 * 用2.1中方法及摸索好的抗原包被浓度和血清稀释度，以上述三组血清为一抗，羊抗人IgG-HRP为二抗检测宫颈癌组和