基因工程5-3 基因的分离、重组及重组体向受体细胞的导入.ppt

5.2 目的基因片段与载体DNA的连接 5.2.1 粘性末端DNA片段的连接 大多数的限制性核酸内切酶都能够切割DNA分子，形成具有1~4个核苷酸的粘性末端。当载体和外源给体DNA用同样的限制酶，或是用能够产生相同的粘性末端的限制酶切割时，所形成的DNA末端就能够彼此退火，并被T4连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。当然，所选用的核酸酶对克隆载体DNA分子最好只具有一个识别位点，而且还是位于非必要的区段内。 ? 这种方法引导的外源DNA片段的插入，可以有两种彼此相反的取向，这对于基因克隆是很不方便的。 ? 5.2.1.2 取代式（双酶切） 根据限制性核酸内切酶作用的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA片段。如果载体分子和待克隆的DNA分子，都是用同一对限制酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组DNA分子。这就是所谓的定向克隆(directional cloning)技术，可以使外源DNA片段按一定的方向插入到载体分子上。 5.2.2 非互补粘性末端DNA片段的连接 载体分子和给体DNA片段经不同的限制酶切割后，并不一定总能产生出互补的粘性末端，多为非互补的粘性末端或平末端。对于平末