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第六章 外源目的基因表达与调控 生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。 外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个重要环节。 基因的转录是在RNA聚合酶的作用下合成mRNA，原核生物mRNA一般不需要转录后加工。 真核生物mRNA在细胞内合成，且需要经过一繁殖加工过程：RNA剪接、5′端加帽、 3′端加上poly(A)尾巴。 原核生物一般没有翻译后加工，真核生物有较复杂的翻译后加工。 第一节 外源基因表达机制 一、外源基因的起始转录 外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。 理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后，在某种特定诱导因子的诱导下，RNA聚合酶开始启动转录，合成mRNA。 二、mRNA的延伸与稳定性 外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。 为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止，可以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。 在表达载体中加入正常转录终止序列，可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，增加外源基因表达的稳定性。 三、外源基因mRNA的有效翻译 外源基因在原核生物中的有效翻译需要考虑： 1. AUG(ATG)是首选的密码子； 2. SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基； 3. SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3~9个碱基； 4. 在翻译起始区的周围的序列不易形成明显的二级结构。 真核细胞mRNA的5′非翻译区不存在SD序列，但绝大多数mRNA的起始序列含有共同序列。 不同生物使用密码子具有不同的偏好性。如果外源基因的mRNA密码子使用受体的偏好密码子，则表达效率高。 mRNA上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响。在原核细胞中，UAA为最常用的终止密码子。 四、表达蛋白质在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物在宿主细胞中的稳定积累，不被宿主蛋白酶所降解，可有效提高表达量。 避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施: 1.构建融合蛋白表达系统。 2.构建分泌蛋白表达系统。 3.构建包涵体表达系统。 4.选择蛋白酶缺陷型的受体系统。 五、基因沉默 基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素，主要出现在转基因动物和转基因植物中。 目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA相互作用的结果。重复序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一，在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列有较高的同源性。 第二节 基因表达的调控元件 一、启动子 启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，一般位于表达基因的上游。 1.序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的序列框。 2.方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件。 3.位置特性。一般启动子只能启动其下游基因的转录。 4.种属特异性。 二、增强子 增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。 1.双向性。正反两个方向调节活性。 2.重复序列。增强子一般含有能独立行使功能的重复序列。 3.功能与位置无关。 4.特异性。组织特异性，或在特定细胞阶段。 5.对异源基因也有调节功能。 三、终止子 终止子是提供终止信号使RNA聚合酶停止转录的DNA序列。 本征终止子指不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。属于强终止子。 依赖型终止子需要ρ因子的辅助，属于弱终止子。 四、衰减子 衰减子是基因表达调控的精细调节装置，利用原核生物转录与翻