细胞培养工程 02B 相关细胞生理.ppt

* 前言 决定重组蛋白质表达的主要因素 表达载体 表达载体整合位点：宿主细胞染色体转录活跃区低于 3% 克隆筛选 合成蛋白质产物的能力的评估 单位时间内每个细胞分泌蛋白质的数量 经克隆筛选后，细胞株为单克隆，其合表达能力基本上已经达到上限，进一步重复筛选、提高产率的空间不大 过程开发与优化 确定产物合成与细胞生长的关系 通过反应器操作与培养基优化， （1）提高活细胞密度 （2）延长高密度培养时间 * 细胞培养工程 南开大学 * 代谢途径 代谢途径 胞内生化反应是在酶催化作用下完成 胞内生化反应不是独立的，而是相互联系、并接受调节（如负反馈抑制），一个反应的产物往往就是下一个反应的底物，由此构成的一连串生化反应，即代谢途径 细胞培养工程 南开大学 * 生物体内代谢活动主要分类 分解代谢 由较大分子（多糖、蛋白质、脂类等）降解为小分子（如 CO2、NH3、H2O、氨基酸、单糖）的过程 作用 为细胞的生命活动提供能量 为合成代谢提供多种前体物质 合成代谢 由小分子（如氨基酸等）合成大分子（如蛋白质）的过程 作用 产生重要的产物 为机体生长和产物合成提供必要的大分子物质 需要能量 细胞培养工程 南开大学 * 正常机体的能量代谢 在正常机体内代谢受严格调控，处于动态平衡状态 代谢途径中关键限速酶的活性调节（酶活性）和合成调控（酶数量）是代谢调节主要方式 机体内代谢调控层次 整体水平：主要通过神经 - 内分泌系统来实现 细胞水平：主要由代谢底物、产物的多少来完成 细胞培养工程 南开大学 * Glycerol Alanine Lactate Intestine Pancreas Triose phosphate Glucose Glycogen Glucose Pyruvate Glucose ⊕ Insulin ⊕ ⊕ Glucose Glucose UDP-Glucose Glycogen Glucose TG Glycerol RBSc Adipose Muscle Liver Lactate Alanine 人体通常状态 细胞培养工程 南开大学 * Glucose Glycogen FA CO2 TG FA Adipose Muscle Liver Fatty acids Glucose Glucose CO2 Brain 人体饥饿状态 FA CO2 Kidney 细胞培养工程 南开大学 * 细胞体外培养代谢 在体外培养中，由于缺少整体水平的代谢调节和组织间的代谢协调作用，细胞自身代谢失去严格调节，常常出现代谢溢流，导致副产物积累，不但浪费原料、恶化细胞生长环境，而且降低细胞培养过程的效率和产率 体内 空腹血糖： 3.9 - 6.2 mM 餐后 1 小时： 7.8 - 9.0 mM 餐后 2 小时： 3.9 - 7.8 mM 细胞培养： 一般低于 25 mM 在体外培养中，大多数细胞往往不能利用大分子营养物，而是以小分子如葡萄糖、氨基酸作为代谢的起点底物，通过糖酵解、三羧酸循环等能量代谢途径，分解葡萄糖或氨基酸，为细胞的生长和产物的合成提供必需的能量 细胞培养工程 南开大学 * 细胞体外培养代谢 能量代谢以及其它代谢途径（如磷酸戊糖途径）的中间代谢产物，是合成代谢的前体物质 分解代谢是一个发散的过程，而合成代谢是一个集合过程 合成代谢一般不是分解代谢的简单逆向反应，而是由不同酶催化，通常需要消耗 ATP，并以NADPH 为主要的还原供氢体 了解体外培养细胞的代谢特点，并在此基础上提出相应的代谢调节策略，对提高细胞培养的效率具有重要意义 细胞培养工程 南开大学 * 糖代谢 – 葡萄糖转运 葡萄糖不能以直接扩散方式进入细胞 在动物体内，葡萄糖可以通过与 Na+ 共转运方式，逆浓度梯度转运至胞内，但需要耗能 通过细胞膜上特定转运载体（葡萄糖转运子）将葡萄糖转运入细胞内，顺浓度梯度转运至胞内，不需要耗能 在体外培养的细胞中，葡萄糖主要通过葡萄糖转运子进入细胞 细胞培养工程 南开大学 * 糖代谢 – 葡萄糖转运蛋白质 葡萄糖转运蛋白质 膜蛋白质，协助葡萄糖跨膜转运 至少有 5 种亚型 （GLUT-1 to 5） Glut 2：? 细胞 / 肝脏 Glut 4：脂肪组织 / 肌肉组织；当在胰岛素与脂肪、肌肉细胞表