《分析生物学讲义-7。基因克隆技术》公开课件（设计）.pptVIP

基因克隆技术 DNA重组技术 （1）限制性内切酶——分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点。 根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。 第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母 第二、三个字母小写 该微生物种名前的2个字母 第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母 罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 从一种微生物中发现了几种限 制酶，按发现顺序排列 如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R株分离得到的第一种限制酶。 分子刀-DNA限制性内切酶 （2）DNA连接酶 常用T4DNA ligase： 来源：噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶 功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。 对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100） （3）载体（vector） 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具， （1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制 （2）具有合适的限制性酶切位点 （3）具有合适的筛选标记 （4）细胞内拷贝数要多 （5）载体的分子量要小 （6）细胞内稳定性高 目前最常用的载体包括细菌质粒、噬菌体、柯斯质粒等。 克隆片段的大小（克隆能力） (1)1kb —— M13 (2)10kb —— plasmid (3)22kb —— λphage (4)50kb —— casmid由噬菌体DNA和质粒DNA的某些功能 片段拼接而成 (5)0.1-0.4Mb —— BAC细菌人工染色体 (6)0.5-2Mb —— YAC 由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成 重组DNA的操作 CaCl2法制备感受态细胞 a.低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态; b.转化混合物中的DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面; C.重组DNA在42℃短时间热激后吸附在细胞表面，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。 4.rDNA的筛选鉴定 筛选： 抗性筛选 蓝白斑筛选 鉴定： 酶切电泳 Southern 杂交 蓝白斑筛选 α-互补（α-complementation）： 在T-vector或 PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸的核苷酸序列（又称α-肽）； 这类载体对应的宿主菌（如JM、DH5α系列）β-半乳糖苷酶基因失去了编码α-肽碱基序列 只有当这类载体引入到宿主菌后，互补产生有活性的β-半乳糖苷酶。 若在多克隆位点插入外源基因，将使lac Z基因片段灭活，不能产生α-互补现象，不能生成蓝色菌落，而保持白色。 二、 基因克隆策略 基因克隆方法的选择 类型I已知基因的序列已知目的基因的DNA/cDNA全部或部分DNA/cDNA序列或已知其它物种的同类基因的序列。 在这两种情况下一般采用PCR技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。 类型II未知目的基因序列（1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。可以采用随机引物多态性扩增技术，mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）和差示分析法（RAD）等进行克隆。（2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测序法等进行，是难度较大较繁琐的策略。 类型III无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆。 1.RACE技术 （rapid amplification of cDNA ends） 在已知cDNA 序列的基础上克隆5’端或3’ 端缺失序列的技术。 应用： 获得全长cDNA，还用于识别5’和3’端非转 录序列，研究转录起始位点的不均一性和启动子区的保守性。 分为5-和3-RACE两种。 3-RACE根据一般基因具有polyA尾巴的特点，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，再用特异引物（GSPs）和PolyT引物PCR即可。 5-RACE相对较难，先用特异引物（GSPs）起始cDNA第一条链的合成，再根据反转录酶末端加C特点,利用dC引物和GSPs PCR 。 2.cDNA差示分析法（RepresentationalDifference Analysis，RDA） 原理： 利用PCR以指数形式扩增双