分子克隆和蛋白纯化.pptVIP

分子克隆和蛋白纯化的概况 主要工作 载体构建 蛋白分离与纯化 蛋白结晶 晶体衍射和数据分析（结构解析） 一.载体构建 也就是基因重组技术，主要包括： 目的基因的获取 克隆载体的选择 外源基因与载体的连接 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选 克隆基因的表达 1.目的基因的获取 化学合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库 cDNA文库 PCR 2.克隆载体的选择 选择克隆载体的几个重要参数 1）实验对象 (供体和受体) 2）实验性质（实验的目的） 3）载体容量 （M13mp载体 细菌质粒载体 10kbλ载cos质粒载体pYAC载体∽1000 kb） 4）合适克隆位点 5）载体的稳定性 6）载体DNA制备的难易 7）外源基因表达产物产量、产物特点等 3.外源基因与载体的连接 最常用的是粘性末端连接同一限制酶切位点连接，要考虑以下三个方面： 载体总量， 载体和插入片段比例， 载体和插入片段质量。 4.重组DNA导入受体菌 我们使用的是转化的方式，受体菌处于感受态。 要注意的是复苏的LB培养基必须无菌而且没有抗生素 5.重组体的筛选 提质粒，酶切或PCR验证； 菌液PCR； 测序。 6.克隆基因的表达  我们用试表达的方法来验证是否构建成功。 如果重组克隆能在宿主菌中