I基因文库筛选.pptVIP

南京林业大学 南京林业大学 mRNA完整性的检测 1)mRNA分子的大小： 哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间. 2)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力 mRNA在细胞中的丰度 1) 高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA 。 2) 低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。 mRNANA RNA 南京林业大学 南京林业大学 第一链cDNA的合成 oligo(dT)引导的DNA合成法： 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。 引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列 第二链cDNA的合成 末端转移酶 DNA聚合酶I缺失5‘至3’外切酶活性的截短部分 南京林业大学 双链cDNA末端的形成及其接头添加 基因组DNA文库 cDNA文库 附：基因组DNA文库与cDNA文库的比较 1 基因组DNA文库的优点 相对于cDNA文库，基因组文库的优点： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。 2 cDNA文库的主要优点 ①cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 ②cDNA文库的筛选比较简单易行。 ③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。 ④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。 ⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。 3 cDNA克隆的主要的缺点 cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。 cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。 在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。 南京林业大学 克隆DNA转移到尼龙膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。 南京林业大学 南京林业大学 南京林业大学 南京林业大学 南京林业大学 放射性抗体检测法 滤膜（固定抗体） + 扣除文库(subtractive library) 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的。 差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂交的筛选效率，一种切实可行的办法是构建富含目的基因序列的cDNA文库。应用扣除杂交筛选法便可达到此种目的。 扣除杂交（Subtractive Hybridization） Section I: Gene libraries and screening Hybrid arrest (杂交扣留) Hybrid arrested translation: cDNA?hybridized mRNA ?proteins Hybridization: Individual cDNA clones or pools (群) of clones can be hybridized to mRNA preparations. The hybridized mRNA can not be translated to proteins, and the detection of protein