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实验六 碱法提取质粒 转到目录 目 录 返回标题 一．目的 二．原理 附：原理示意图 三．试剂 四．器材 五．注意事项 六．操作步骤 1 六．操作步骤 2 六．操作步骤 3 GFPuv质粒的信息图片 GFPuv vector’s Description Location of features 1 Location of features 2 Location of features 3 Location of features 4 Vector’s Primer Location Propagation in E. coli 一．目的 了解提取质粒的原理。 学习和掌握质粒提取的方法和技术。 ——三个基本步骤： 细菌的生长和质粒的扩增 菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 质粒DNA的纯化 返回目录 返回目录 二．原理 质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基体的实验技术。 质粒的提取是利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同和性质的差异性进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分子易断，经加热或碱处理后容易变性并产生沉淀，即使冷却或碱性被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析出。质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因加热或碱处理等被折开，加热冷却或恢复中性PH后又呈天然构型，溶解在溶液中。这样通过加热或碱处理后又中和PH，再用离心的方法就可把质粒DNA提取出来。 ☆原理示意图 返回目录 ☆原理示意图 返回目录 返回原理 三．试剂 1. LB培养基 detail 2. STE detail 3. 溶液 I detail 4. 溶液Ⅱ detail 5. 溶液III detail 6.　3M乙酸钠(pH5.2) detail 7. TE(pH8.0) detail 返回目录 LB培养基 back 配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入： 细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g NaCl　10g 摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/L NaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。 STE back 0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris·Cl (pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。 溶液 I back 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 在10 lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。 溶液 II back 0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释) 1% SDS 溶液 III back 5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液重钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。 3M乙酸钠(pH5.2） back 在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 在800ml 水中加入 186.1g EDTA-Na·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0 (约20g NaOH颗粒)，然后定容至1 L，分装后高压灭菌。 TE(pH8.0) back 10 mmol/L Tris·Cl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0) 50×TAE 242g Tris 碱 57.1 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0) 四．器材 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 离心机 4. 电泳仪和电泳槽 5. 玻璃器皿与耗材 量筒、三角瓶、平皿; EP管(1.5ml, 0.5ml); 枪头(1ml, 0.2ml, 10μl); 牛皮纸、纱布、牙签等 返回目录 五．操作步骤 1 挑选一个单菌落，接种到含适当抗生素的3ml LB培养液中，37℃振荡培养14~16小时。 取1.2 ml菌液，12,000rpm