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实验二十　碘淀粉比色法测定血清淀粉酶 淀粉酶又称α－1，4葡聚糖水解酶，作用于多糖分子中的1，4糖苷键，生成麦芽糖和葡萄糖。可由肾脏排泄，淀粉酶在人体内的分布很广，但主要存在于胰腺，唾液腺及其分泌液中，对食物中多糖化合物的消化起重要作用。血清淀粉酶主要有两种同工酶，即同工酶P（来源于胰腺），及同工酶S（来源于唾液腺及其它组织）。血清淀粉酶增高对急性胰腺炎有诊断价值。多年来，由于它的测定方法简单，快速，一直被用于胰腺炎的诊断和急腹症的鉴别诊断，但其总酶活力测定缺乏灵敏性和特异性，而其同工酶分析则有助于克服这些缺点。淀粉酶活性测定方法大致分为粘度测量法、比浊法、碘量法、糖化法和染料释放法5种，其中碘淀粉比色法操作简便，结果可靠在临床上得到广泛的应用。 【原理】 血清中α淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1，6糖苷键支链的糊精。在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较，从而推算出淀粉酶的活力单位。 【操作】 1.血清先用生理盐水作10倍稀释。0.1ml血清＋0.9ml蒸馏水。 加入物(ml) 测定管 对照管 缓冲淀粉溶液 (37度预温5min) 1.0 1.0 血清 － 0.2 37度水浴7.5min 碘应用液 1.0 1.0 蒸馏水 6.2 6.0 2.混匀，以波长660nm，蒸馏水调零，读取各管吸光度。 单位定义　100ml血清中的淀粉酶，在37度15min水解淀粉5mg为1个单位。 【计算】 淀粉酶＝空白管吸光度－测定管吸光度/空白管吸光度*0.4/5*15/7.5*100/0.02 如进行时间进程曲线其相应的时间应取不同的值。 【参考范围】 血清80-180，尿液　100-1200 【临床意义】 淀粉酶可通过肾小球滤过。流行性腮腺炎，特别是急性胰性炎时，血和尿中的AMY显著增高，急性胰腺炎发病后8-12小时血清AMY开始增高，12-24小时达高峰，2-5天下降至正常。如超过500U有意义，350达U时应怀疑此病。而尿AMY约于发病后12-24小时开始升高，下降也比血清AMY慢，因此，在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价值。急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌、胆石症、溃疡病穿孔及吗啡注射后等均可见血清AMY增高，但常低于500U。 由于正常人血清中AMY主要由肝产生，故血清与尿中AMY同时减低主要见于肝炎、肝硬化、肝癌及急性和慢性胆囊炎等。肾功能障碍时，血清AMY也可降低。 【注意事项】 1,酶活性在400U以下时，与底物的水解量成线性，如测定管吸光度小于空白管吸光度一半时，应加大血清稀释倍数或减少稀释血清加入量，测定结果乘以稀释倍数 2,草酸盐、枸椽酸盐、EDTA-NA2及氟化钠对AMY活性有抑制作用，肝素无抑制作用。 3，唾液含有高浓度淀粉酶，须防止带入。 4，淀粉产品不同，其空白吸光度可有明显差异，一般空白吸光度应在0.4以上。 5，缓冲淀粉溶液若出现混浊或絮状物，表示缓冲淀粉溶液受污染或变质，不能再用，应重新配制。 6，本法亦适用于其他体液淀粉的测定，尿液先作20倍稀释后测定。 【评价】 本法线性范围＜400U，批内3.1-9.0%，批间12.4-15.1%，与对-硝基苯麦牙庚糖苷法比较，在酶活性低时相关性较好，但酶活性较高时相关性差，因此，该法不能认为是淀粉酶测定的理想方法，但由于该法简单，易行，不需特殊设备，试剂价廉，仍然为我国目前应用较为广泛的方法。 1、比色法测乳酸脱氢酶 正向反应生成的丙酮酸与溶于酸的2，4二硝基苯肼作用生成丙酮酸－二硝基苯腙，后者在酸性环境中呈草黄色，在碱性溶液中显棕红色，颜色的深浅与丙酮酸的浓度成正比，与标准浓度的丙酮酸生成的苯腙进行比色，可推算LDH的活力。 单位定义：以100ml血清，37度，作用底物15min，产生1umol丙酮酸为一个金氏单位。 2、血清谷—丙转氨酶活性的测定（改良赖氏法） 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成