第五章基因克隆分离.pptVIP

预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 二、基因组文库的构建与基因分离 　　基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。 （一）基因组文库（genomic library） （二）基因组文库应满足的条件 1、文库的完整性 2、基因组信息的可重建性 3、文库的大小 （三）基因组文库构建的一般步骤 1、染色体DNA的分离 2、大片段的制备 3、载体的制备 4、重组连接 5、包装 6、重组噬菌体感染大肠杆菌 基因组文库 （四）基因组文库的筛选 筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来 探针筛选法：两步或三步原位杂交法 （一）cDNA library 　将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。 三、cDNA文库的构建与筛选 （二）cDNA文库应满足的条件 　　1、文库的代表性 　　2、序列的完整性 （三） 构建cDNA文库的一般步骤 （1）总RNA（total RNA）提取 （2）mRNA的分离纯化 （3）cDNA的合成 （4）cDNA与载体连接 （5）重组载体转化受体菌 ① 基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。 ② 基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。 ③ 基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。 Genomic library与cDNA library区别 第四节 基因差异表达获得目的基因 　　在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，称为基因的差异表达。 　　真核基因总数约为100 000个，但在一定的发育阶段、在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达，产生出大约15 000种不同的mRNA分子。　　 一、 差异显示PCR（DDRT-PCR） DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术 （1）3’ 锚定引物 Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT M：A、G or C N: A、G、T or C 5’ 3’ 利用mRNA的poly A尾巴设计 利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增 12种锚定引物 AG TTTTTTTT 5’ 3’ CG TTTTTTTT 5’ 3’ GG TTTTTTTT 5’ 3’ TG TTTTTTTT 5’ 3’ AA TTTTTTTT 5’ 3’ CA TTTTTTTT 5’ 3’ GA TTTTTTTT 5’ 3’ TA TTTTTTTT 5’ 3’ AC TTTTTTTT 5’ 3’ CC TTTTTTTT 5’ 3’ GC TTTTTTTT 5’ 3’ TC TTTTTTTT 5’ 3’ 　这些引物由11~12个T及两个其它的碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示。 　　使用这种锚定引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。 （2）5’端的随机引物 同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5’端又设计了20种10bp长的随机引物。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT 5’ 3’ RT NM TTTTTTTT 5’ cDNA 3’ NNNNNNNNNN 5’ 3’ cDNA第二链，并PCR （3）用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增 12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。 引物组合： 实验结果： 如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。 在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。 240组能分出20000多条带！ （4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较 相同引物对在不同来源cDNA中的PCR产物并排电泳 选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA