常见生化和分子生物学技术.ppt

常见的生化与分子生物学技术;生物大分子的提取和纯化;;生物化学研究技术方法;生物大分子分离纯化的一般步骤和原则;要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力。 ;分离纯化的一般程序;生物大分子的浓缩; 超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。 透析浓缩法 减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。 冰冻干燥法 ;纯度鉴定;蛋白质、核酸的定性定量检测;核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。 同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。;电泳基本原理;电泳;影响泳动度的因素： 1. 电场强度： 电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。 2. 溶液pH 为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。 3.离子强度（I） 溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。 ;;电泳技术分类;;2. 琼脂糖凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶有下列优点： 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。 化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。 对pH和温度变化较稳定。 几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。 凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。;;凝胶聚合的原理及有关特性 催化系统常用有两种： 过硫酸氨—TEMED化学催化聚合系统 此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。 核黄素—TEMED光聚合催化系统 此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。;凝胶聚合的原理及有关特性 影响凝胶聚合的因素 AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP应在干燥、避光的条件下保存，其水溶液应置棕色瓶中，4℃冰箱贮存，一般仅能存放一周。TEMED（液状）应密闭贮于4℃冰箱中。增加AP和TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。 pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。 温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温(5℃)聚合凝胶会变得脆 而混浊，一般25-35℃聚合较好。 氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气，再加引发剂。 ;PAGE原理 PAGE据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类。 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应； 不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。 不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。;聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。 所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。 由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr