应用PCR进行水稻染色体末端区域作图.pdf

遗 传 学 报，25(6):508-516,1998 ActaGeneticaSinica 应用PCR进行水稻染色体末端区域作图 沈利爽 朱立煌 中（国科学院遗传研究所植物生物技术实验室 北京 100101) 摘要 利用RAPD引物介导的不对称复性温度PCR的方法 R（M-PCR)，发展了一+Tt]c于端粒 重复序列的新型分子标记。并在一个釉梗杂交来源 窄（叶青8号x京系 17)的水稻4}单倍体 群体中进行了端粒重复相关顺序的遗传定位。在23个定位位点中，有 12个定位在水稻8个染 色体臂的最远端，并将所在染色体分别向外延长了7.7-22.6cM。其中有些可能是定.L在亚端 粒区。有5个位点被定位在着丝粒区，另外6个位点定位于染色体内其他区域。 关键词 水稻 O（ryzasativaL.)，遗传定位，端粒重复顺序，端粒重复相关序X11(TASs), RM-PCR 分类号 Q943 构建遗传图谱使用的分子标记往往难以有效地覆盖染色体末端区域。！！前对染色体 末端区域的分子标记定位主要是利用各种方法克隆其端粒或端粒相关序列．然后利用克 隆的序列作探针，通过RFLP分析进行遗传定位，以获得对染色体末端区域的浸盖[1-5l。有 时则采用与端粒保守序列一致的寡核昔酸作探针[6-81。此类方法技术上比较Q杂，还受到 近端粒区限制性酶切位点分布的限制。此外，由于此类克隆常为重复序列，日．有时这些标 记在作图群体双亲之间没有多态性，给RFLP定位分析增加了困难。最近，Mao等利用 Vectorette法克隆小麦端粒相关序列 T（AS)，并依据其序列设计引物，与端粒币复序列引物 配合，通过PCR反应对TAS进行定位。但该法需大量测序及引物合成，且阳J比率较低4]‘0 参考已发表的一些半特异PCR方法[9,［10]，我们发展了一种由RAPD引物介导的半特 异性PCR方法 R（APDprimermediatedhemi-specificPCR,RM-PCR)，用j·,Q展基于端 粒重复保守序列的PCR分子标记，以增加遗传图谱对染色体末端的覆盖度。该法的原理 在于利用RAPD引物与端粒重复顺序的特异引物配合，采用不对称复性温度PCR的方法， 使高严谨性循环与低严谨性循环交替进行，对端粒重复相关序列进行扩增。在高严谨性 循环中，只有较长的端粒重复顺序特异引物可以起始DNA合成；而较短的RAPD引物只 有在低严谨性循环中才能起始DNA合成。因此通过调整循环反应的条件，可以使由端粒 重复顺序特异引物参与反应所得的特异性产物在产量上远多于由RAPD引物单独起始的 非特异性产物。 端粒重复顺序主要分布于染色体末端和着丝粒区域[11.12]。端粒重复单位在生物中有 高度的保守性，已证明拟南芥的端粒重复序列 C（CCTAAA)n在许多植物中是保守的，水 本文于1997--05-13收到，1997-07-25修回 6期 沈利爽等：应用PCR进行水稻染色体末端区域作图 509 稻也不例外[8l。在最近克隆的玉米端粒中也发现有此重复顺序fzl［a囚此我们根据这一序 列，设计了水稻的端粒重复顺序特异引物。并参考番茄中端粒顺序 ’‘’“的分析，在部分引物 最后一个重复单位中设置一个简并碱基，加5-CCCT(TIA)AA--3 迄今，利用各种方法在水稻的不同作图群体中已定位了12对染色体的24个端点中的 6个[8,［14]。尚有18个端点未曾被定位过。本研究利用RM-PCR方法，在一个水稻双单倍体 (DH）群体中对8个端点进行了遗传定位。 1 材料和方法 1.1作图群体构建和遗传图谱构建 以典型釉稻窄叶青8}(ZYQ8)和典型粳稻京系 17(JX17)为亲本，对其E代花药进行离体培养，获得双单倍体D（H)柏侏。选用稳定的127 个DH系构建DH作图群体’s［l。RFLP分析按以前的报道进行”［〕。利川MapmakerV.3.0软 件，作出分子标记的连锁图，利用Kosambi函数将重组率转换为遗传图距。 1.2 引物设计和引物末端标记 端粒重复特异引物序列5端含有2个或3个已知在高 等植物中保守的端粒重复单位，引物在3端‘分别增加 1个或3个选择性碱基，以保证扩增 产物是在由端粒重复单位与其他