多重pcr技术介绍.ppt

多重PCR技术 讲解框架 第一、多重PCR技术原理 第二、多重PCR实验设计：大致的如何操作 1、 多重PCR扩增区域的选择 2、 引物的设计（关键步骤） 3、多重PCR反应条件的确定 第三、多重PCR条件优化 1、反应体系优化 2、引物设计 3、模板核酸质量 4、循环参数优化 第四、多重PCR技术结果分析 第五、多重PCR技术在食品中的应用 一、多重PCR技术原理 PCR是什么：聚合酶链式反应。是一种体外快速扩增特定基因或DNA片段的分子生物学技术。 其基本原理是：以一对寡核苷酸为引物，在模板DNA、dNTP(脱氧核苷三磷酸) 、适当缓冲液Mg2+的混合体系中，在DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，对引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增通过模板DNA与引物之间的变性、退火和延伸三个步骤为一循环，每次循环产生的DNA片段作为下次 循环的模板，所以PCR扩增产物呈指数增加。多重PCR是在传统PCR原理的基础上进行改进，即在同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。 二、多重PCR实验设计：大致的如何操作 所要求的东西主要是：菌株、培养基、供试药物、试剂 培养基：分离培养基、增菌培养基 主要试剂：Taq DNA聚合酶，dNTPs 主要仪器：PCR仪、恒压恒流电泳仪、凝胶成像仪、常温离心机、浴式振荡器、电热恒温水浴锅等等 操作方法：第一、多重PCR扩增区域的选择 由分析目的来决定：缺失分析选择扩增外显子 法医学鉴定个体差异选择扩增高度多态性标志 微生物鉴别分析可能利用种或株DNA特异性变化区域 转基因检测则选择转入的动植物基因座 性别鉴定一般挑选X或Y性染色体上特有的基因座 第二、引物的设计（关键步骤） 1、引物位置的确定：首先需要知道所选择的基因引物位点的详细DNA序列信息。 引物的DNA序列应该有很强的特异性，否则引物会结合在其他位点上发生非特异性扩增。 2、引物序列的测定：引物的设计是多重PCR成功的重要保证：事先通过GDB（基因数据库）、NCBI（生物技术信息中心）查引物相关位点的DNA序列信息。 3、引物序列的比较：引物间连续互补不能超过4bp，以防止发生交叉错配。 第三、多重PCR反应条件的确定： 首先进行单个PCR，分别设定各引物对反应条件。然后，依次增加引物对，不断调整反应条件直至最后保证所有的引物对都能在同一条件下扩增出目的条带。 多重PCR技术在植物病毒检测中温度的确定 三、多PCR条件优化 多重PCR是在传统PCR基础上改进并发展起来的，但并不是单一PCR的简单混合，在实际操作中常常受到反应条件和反应体系等多种因素的影响。 1、反应体系优化原则 1、确保所有的靶位点可以用相同的PCR程序在单个反应中得到有效的扩增； 2、在使用相同的PCR程序和反应条件的单个PCR中对每对引物的量进行优化，以达到最大的扩增效率； 3、平衡多重PCR中每对引物的量，使之对每个靶点都能获得足够的扩增量。 2、引物设计（关键优化） 多重PCR中的每对引物必须满足单引物PCR体系的引物设计原则。这些原则包括：引物与模板的序列紧密互补，长度一般为15—30bp，GC含量一般为40—60％；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。由于多重PCR体系中同时存在多对引物，在引物设计时还应注意：各引物对必须保持高度的特异性，避免非特异扩增；尽可能避免所有引物间的相互作用，各引物对应保持相对一致的扩增效率，且不同引物对扩增出来的产物能通过电泳或其他方法区分开。 3、模板核酸的量 模板核酸的量和纯度是PCR成败的关键环节之一。模板量太少，会出现阴性结果或条带很弱；模板量太多则会出现条带弥散，模糊不清；模板纯度低或被降解会导致扩增的不整齐。模板核酸片段还必须具有高度的特异性，以避免非特异性扩增，保证检测的准确性。另外，各片段长度应具有明显差异，以有利于扩增后产物的区分。 4、循环参数的优化 在传统PCR反应中，一个体系通常采用一个退火温度。在多重PCR体系中，不同长度的模板核酸片段、不同的引物对所要求的退火温度不一样。黄银花等人通过研究证实，在15 u L的反应体系中含有多个退火温度的多重PCR反应条件的扩增效果比采用一个退火温度的效果好，基本能满足多重PCR的要求。一般来说，在解链温度Tm值允许范围内，选择较高的退火温度。 多重PCR的退火时间比传统PCR稍微延长，有助于引物与模板的完全结合。延伸时间则要根据模板核酸的长度决定。黄银花等经过反复的优化实验发现，多重PCR的延伸时间比传统PCR循环时延伸时间为40s长，他们认为循环时延伸时间为1min的扩增效果好，扩增产物加尾整齐。 5、反应体系优化 由于多重PCR体系中加入多对