HRM应用实验相关设计与结果分析.pptVIP

第七步：检查二级结构 第八步：将引物序列与该物种基因组序列相BLAST，以确定其特异性 三、反应体系 Component Concentration Diluent (Mol. Biol. Grade water) - PCR Buffer 1X MgCl2 1.5 mM dNTPs 0.2 mM Forward primer 300 nM Reverse primer 300 nM SYTO?9 1.5 μM EvaGreen 1-2X Taq DNA polymerase 1.25 U DNA Template 3 x 109 copies/μL 所需的试剂与耗材 试剂 耗材 热启动Taq Platinum? Taq DNA polymerase (Invitrogen) Hotstart Taq (Qiagen) 10X PCR 缓冲液 随Taq酶 50 mM MgCl2 随Taq酶 100 mM dNTP溶液 Invitrogene, NEB等 饱和内掺染料 SYTO 9 (Invitrogen) EvaGreen (Biotium) LC Green (Idaho Technology) Eco plates Eco Adhesive Seals 试剂的处理与保存条件 Reagent Storage Temp. Storage State Taq DNA polymerase –20oC Not Critical 10X PCR Buffer –20oC Not Critical 50 mM MgCl2 18–24oC Not Critical 100 mM dATP Solution –20oC Not Critical 内掺染料 –20oC Dark 软件设置 演示 四、结果分析 标准视图： 差异视图： 谢谢！ 专才服务专家 * * * * * * * * This is analyzed or normalized data. This is two homozygote samples, differing by one base pair, a C homoduplex and a T homoduplex and are easily differentiated by difference in Tm. Knowing this you can easily predict that the green is the T because of the two hydrogen bonds and the red is the C, for it has stronger 3 hydrogen bond and will melt later. * * This is analyzed or normalized data. This is two homozygote samples, differing by one base pair, a C homoduplex and a T homoduplex and are easily differentiated by difference in Tm. Knowing this you can easily predict that the green is the T because of the two hydrogen bonds and the red is the C, for it has stronger 3 hydrogen bond and will melt later. * 荧光定量PCR应用 ——高分辨率溶解曲线（HRM） CMK Robert Wang 2011-11-07 内容 一、背景介绍 二、实验设计 三、反应体系 四、结果分析 一、背景介绍 HRM分析技术 高分辨率熔解（High Resolution Melting，HRM）分析技术是基于核酸的物理性质，通过饱和的插入染料监控DNA熔解曲线变化而进行分析的一种技术。 HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，无需使用序列特异性探针，具有高灵敏度、操作简单、高通量、成本低等优点。 HRM是美国犹他大学保健科学中心病理学部Carl Wittwer实验室与美国Idaho Technology公司于2003年共同合作开发出来的建立在实时荧光基础上的分析技术，并于2006生产出世界上第一台HRM仪器HR-1。 HRM分析过程 原始曲线 随着DNA熔解，插入DNA双链中的染料被释放，荧光信号骤降 导数图 “速率”曲线的最高峰是分离速率最大的点，即等于熔解温度 对PCR的扩增子进行加热，温度 从50℃逐渐上升到95℃。扩增子逐渐解