酶分离的纯化.ppt

* * 层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 * * * * 按层析过程的机理分类 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 （4）凝胶层析 凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微 孔内，不断地进出于颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。 （4）凝胶层析 常用的凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂凝胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 类型 工作范围（相对分子质量） 床体积/（ml/g干胶） 葡聚糖凝胶 Sephadex G-10 200 2～3 G-15 150 2.5～3.5 G-25 1 000～6 000 4～6 G-50 1500～30 000 9～11 G-75 30 000～70 000 12～15 G-100 4 000～150 000 15～30 G-150 5 000～400 000 20～30 G-200 5 000～800 000 30～40 葡聚糖/双丙烯胺凝胶 Sephacryl S-200 5 000～250 000 S-300 10 000～1 500 000 S-400 20 000～8 000 000 介质的特性 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。 （5）亲和层析 亲和层析的四个要素 酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶RNA与互补的RNA分子或片段、RNA与互补的DNA分子或片段等之间都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用. 常用的亲和介质及专一性配体 （5）亲和层析 根据欲分离组分与配基的结合 特性，亲和层析可以分为： 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析 （5）亲和层析 层析分离 疏水层析与反相层析的基本原理 （五） 电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。 制备式电泳通常以不含SDS的原态disc进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色带的位置。 按所用支持体不同，