pcr技术介绍详解.ppt

1)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组文库。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 2）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.01∶0.5μM，关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物 低浓度引物 3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 4）实时定量PCR(real-time PCR): 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积荧光值，可以很好的推算模板的起始浓度 实时PCR技术原理 探针设计一般应符合以下条件： ①探针长度应在20～40个碱基左右，保证结合特异性。 ②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。 ③避免与引物发生杂交或重叠。 ④探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。 另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。 6、PCR反应流程 1、温度与时间的设置 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃退火，然后快速升温至70～75℃延伸， 对于较短靶基因（长度100～300bp）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。 ① 变性温度与时间： 一般93℃～94℃，1min足以使模板变性 若低于93℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 ② 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 ③ 延伸温度与时间： 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 2、循环次数 循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在30次左右 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 七、PCR产物检测 琼脂糖凝胶电泳——最常用 聚丙烯酰胺凝胶电泳 层析技术 —高效液相色谱（HPLC） —离子交换层析（IEC） 分子杂交 限制性内切酶酶切分析 PCR扩增产物的直接测序 八、常见问题分析 不出现扩增条带 分析原因：模板、酶失活或污染、引物对的质量和浓度、PCR产物电泳检测时间一般为48h内 2. 假阳性 分析原因：模板或扩增产物的交叉污染 3. 非特异性扩增带 分析原因：引物与靶序列未完全互补或引物聚合形成二聚体、镁离子浓度过高、退火温度过低、酶不合格或酶量过多 4. 出现片状拖尾或涂抹带 分析原因：模板降解、酶不合格或酶量过多、镁离子浓度过高、退火温度过低、dNTP浓度过高、循环数过多 九、PCR技术应用领域 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… 谢 谢 观 赏 * * * PCR技术详解 一 二 三 四 五 PCR简史 定义 基本原理 反应要素 PCR的类型 六 PCR反应流程 目录 八 常见问题分析 九 PCR技术应用领域 七 PCR产物检测 一、PCR简史 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难