gstpull-down实验技术介绍.ppt

* * * * * * * Western Blot GST pull-down 实验技术 主讲：段志强 GST pull-down原理 GST pull-down实验流程 GST pull-down原理： GST?pull?down?是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法。 原理： 利用DNA重组技术将已知蛋白与GST (Glutathione S transferase) 融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。 GST pull-down原理： 基本原理： 假定A蛋白和B蛋白可能有相互作用，将纯化的融合GST标签的A蛋白和纯化的B蛋白以及能特异结合GST的Sephrose?4B?beads?孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS电泳，通过Western blotting检测，可以看见GST-A和B分别对应的条带,表明A和B因相互作用而被GST-A?pull-down；而GST对照组始终仅有一个条带。 GST pull-down 示意图 GST pull-down应用 用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白 GST pull-down流程 GST-A融合蛋白的制备 B蛋白的制备 体外蛋白的结合 Western blot检测 1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化 1. GST-A融合蛋白的制备 1.1 GST-A融合蛋白的表达 1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜； 2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220 rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.6; 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG 0.5mM，20℃，200 rpm培养10~16小时）; 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清（如需要该步沉淀能保存在-80℃）； 1.1 GST-A融合蛋白的表达 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L。 1.2 GST-A融合蛋白的纯化 1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%Glutathione Sepharose 4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min； 2、 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合了GST-A融合蛋白。 3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清; 4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose； 1.2 GST-A融合蛋白的纯化 5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮5~10min。 6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS和WB检测。 B蛋白的来源： 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达 2. B蛋白的制备 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜； 2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.6; 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）; 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清（如需要该步沉淀能保存在-80℃）； 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重