荧光定量pcr检测项目精编版.pptVIP

* * * * 血清型9种，但无特殊的临床意义。 基因型：研究者[4 ]进一步分析了18 株不同血清型HBV 全基因序列,建立了以HBV 全基因序列核苷酸异源性≥8 %为不同基因型的分型标准,并将这18 株HBV 划分为A ,B ,C ,D 4 种基因型。依据这个分型标准,Norder 等[5 ] 1994 年发现基因型E 和F ; Stuyver 等[6 ] 2000 年发现基因型G; Arauz2Ruiz等[7 ]2002 年发现基因型H;至今为止已发现A～H8 种基因型。 * * HBV-DNA定量 乙肝基因分型 乙肝拉米夫定耐药 HCV-RNA定量 病毒性脑炎 实时荧光定量PCR 方法 ------TaqMan法　　 方法： TaqMan法 TaqMan---水解型杂交探针 与目标序列互补 5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Forward Primer Reverse Primer TaqMan? Probe R Q Taqman实时PCR的反应过程 Displacement 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Forward Primer Reverse Primer R Q Hydrolysis 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Q R Polymerization Completed 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ R Q 每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光 实时荧光定量PCR定义 　在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR 原理　　　　　实时原理 常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR原理　　　　　　定量原理 如何对起始模板定量？ 　　　通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value Ct值的重现性 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 定量原理 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性