生物芯片的技术介绍.ppt

4.蛋白质芯片主要形式—抗体芯片 * -Cloning and expression of 6600 yeast protein -Complex arrays for protein-protein interaction studies Zhu et al. (2001)Science.293,2101 4.蛋白质芯片的应用实例—表达谱芯片 * 5. 蛋白质芯片的应用 疾病诊断 药物开发 蛋白质组学 * * * * * 存在的问题 成本过高，需一系列昂贵的仪器 芯片的标准化问题 提高芯片的特异性、简化样品制备和标记的操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等 * 蛋白质芯片的发展方向 建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。 改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合 提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性 研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。 * 第四部分 组织芯片 * * * * * 芯片实验室 将样品制备、生化反应、检测等过程集成化形成的微型分析系统 目前技术上存在一系列难题，离应用尚有一定的距离 缩微芯片实验室是生物芯片未来发展的主流方向之一，也可认为是生物芯片技术发展的最终目标。 * 本章重点掌握的内容 掌握生物芯片标准。 掌握基因芯片、蛋白质芯片的工作原理及制备基本步骤。 * 基因芯片实验步骤 芯片的制备 样品的准备 分子杂交 信号检测与结果分析 * 1.芯片的制备 生物芯片主要以玻璃片、硅片为载体，制备方法基本上可分为两大类－原位合成和预合成后点样。 * 1.1 支持物的预处理 载体材料要求： ①载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联。 ②载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学的稳定性。 惰性:是指载体的其他性能或特异性吸附都不应该干扰生物分子的功能。 稳定性:是指在进行分子杂交或结合时，可能遭受一定的压力或酸、碱条件而不发生变化。 ③载体具有良好的生物兼容性，以便制作不同类别的芯片。 硅芯片、玻片和瓷片,需进行预处理,使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。 * * 1.2 芯片的制作 目前常用的生物芯片制作方法：接触点样法、喷墨法、原位合成法。 接触点样法： * 喷墨法 * 原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位光刻DNA合成技术。 基因芯片制作流程动画 /v_show/id_XMTI1NTg1NDc2.html * 生物芯片3种制作方法 * * 点样仪 * * 探针的固化：打印探针后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定。 * 2.样品的准备 样品的分离纯化：DNA , mRNA 扩增：PCR, RT—PCR 探针的标记： 荧光标记（常用Cy3、Cy5） 生物素 放射性标记 通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对探针的标记。 * 高密度芯片的分析一般采用荧光素标记探针，通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。 常用的双色荧光试剂有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。 * 3.分子杂交 该反应是指标记的样品与芯片上的靶基因进行杂交，产生检测信号的过程。 与经典分子杂交的区别：杂交时间短，30分钟内完成,可同时平行检测许多基因序列。 影响杂交反应的因素：靶分子的浓度、探针浓度、靶分子和探针的序列组成、盐浓度、杂交温度和反应时间、DNA二级结构等。 * 4.信号检测与结果分析 如果是用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影； 若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，得到待测样品的相应信息。 激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号 软件进行进行图象分析和数据处理 * 基因芯片流程动画 /figure/200407/58277.html * 3.基因芯片在功能基因组研究中的应用 根据基因表达谱的特征，进行疾病相关基因的识别与寻找。 根据基因表达谱的变化研究，寻找新的药物作用靶点和效应基因分子，进行药物作用机理的深入研究。 根据特征基因的表达水平，进行诊断、预后、分类。 联合应用基因敲出，RNAi和基因芯片技术识别信号传到通路。 * 第三部分 蛋白质芯片 蛋白质芯片是指在固相支持物上有序排列的各自独立的多肽、蛋白或相应配体，利用蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA，或与其它配体间的相互作用，同时平行分析大量蛋白质