Rp-HPLC法测定竹节参药材中三萜皂苷元齐墩果酸的含量.docVIP

Rp-HPLC法测定竹节参药材中三萜皂苷元齐墩果酸的含量△ 1 仪器与材料 1.1 仪器 Waters 2690型高效液相色谱仪及柱温箱，Millennium32色谱工作站，996型二极管阵列检测器，均为美国Waters公司产品；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AB204-N电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。 1.2 试药 色谱分析用甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水；齐墩果酸对照品（批号110709-200304）购自中国药品生物制品检定所。 1.3 药材 竹节参药材直接从湖北五峰、恩施地区以及四川峨嵋地区采集，由宜昌市药检所中药室鉴定，均为正品竹节参Panax japonicus C.A.Mey.。药材阴干后拣除泥沙，打粉过筛备用。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱为YMC–pack ODS-AQ柱（250 × 4.6 mm，粒径5 μm）；流动相为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（90∶10∶0.04∶0.02）；检测波长为210 nm；流速为1.0 mL· min-1；柱温为30℃。理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于4000。竹节参样品溶液和齐墩果酸对照品溶液的色谱图见图2-B，C 1 –齐墩果酸 图2 竹节参未水解样品（A）、水解样品（B）和齐墩果酸对照品（C）的色谱图 Fig. 2 HPLC chromatograms of sample solution and standard solution （A is the pre- hydrolysis sample, B is the hydrolytic sample, and C is the OA） 2.2 供试品溶液的制备 取竹节参药材粉末（过四号筛）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40 min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10 mL，回收溶剂至干，残渣加25%盐酸20 mL、三氯甲烷25 mL，加热水解1.0 h，水解物用三氯甲烷振摇提取2次，每次25 mL，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 2.3 水解条件的确定 竹节参样品在制备供试品溶液的过程中，水解条件之中的酸种类、酸浓度以及水解时间可直接影响齐墩果酸苷元含量，本试验采用单因素试验法对其进行考察：取竹节参药材粉末（过四号筛）适量，称定后按照“2.2”项下的方法操作，至水解时，分别独立考察六种酸种类（15%盐酸，25%盐酸，浓盐酸，5%硫酸，10%硫酸，20%硫酸）和四个时间水平（0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h）。通过比较测得峰面积积分值，得到最佳水解条件，结果见表2。 表2 不同水解条件对三萜苷元齐墩果酸含量的影响 Tab. 2 Effect of hydrolysis condition on the content of OA in Rhizoma Panacis Japonici 水解条件 Hydrolysis condition 项目内容 Levels of hydrolysis condition 齐墩果酸峰面积 Peak area of OA 最佳水解条件 Results of hydrolysis condition 水解酸种类 15%盐酸 4739952 － 25%盐酸 6998028 25%盐酸 浓盐酸 6361218 － 5%硫酸 89982 － 10%硫酸 249739 － 20%硫酸 589376 － 水解时间 0.5 h 6205902 － 1.0 h 6323428 1.0 h 1.5 h 6333646 － 2.0 h 6314820 － 2.4 样品的定性分析 将竹节参皂苷提取液经彻底水解后进行HPLC色谱分析，在相同色谱条件下进样对照品，以保留时间和紫外吸收光谱对色谱峰进行归属，确定水解样品中主要含有齐墩果酸（峰1）；将水解前后的竹节参样品溶液进行HPLC色谱的对比分析，发现未水解的样品溶液中几乎不见齐墩果酸的色谱峰，表明竹节参样品中游离型齐墩果酸含量很少。竹节参未水解样品、水解样品和对照品的色谱图见图2-A，B，C。 2.5 样品含量测定的方法学考察 2.5.1 精密称取齐墩果酸对照品适量，置10 mL 量瓶中，以甲醇制成每1 mL含1.18 mg的对照品溶液。在“2.1”项色谱条件下，分别精密吸取该对照品溶液4，6，8，10，15，20 μL进行测定。以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程：Y = 444 293.609 X + 17 052.413，r = 0.