《实验六 细菌的生化试验》.docVIP

实验六 细菌的生化试验 目的要求 1．通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解； 2．掌握常规细菌生化试验操作方法。 操作步骤 一、糖类发酵（分解）试验 原理：细菌含有分解不同糖（醇、苷）类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力也不一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由兰变黄（指示剂溴麝香草酚兰由兰遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为兰色。 （一）适用于需氧菌的方法 培养基 用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液（蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100ml，pH7.6按0.5～1％的比例分别加入各种糖），每100ml加入1.2ml的0.2％溴麝香草酚蓝（或用1.6％溴甲酚紫酒精溶液0.1ml）作指示剂。分装于试管（每一个试管事先都加有一枚倒立的小发酵管），10磅高压灭菌10分钟。 如在培养基中加入琼脂达0.5～0.7％，则成半固体，可省去倒立的小发酵管。 0.2％溴麝香草酚蓝溶液配法： 溴麝香草酚蓝 0.2g 0.1N NaOH 5ml 蒸馏水 95ml 方法：从琼脂斜面的纯培养物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中（如为半固体，应穿刺），在37℃培养，一般观察2～3天，观察时用上述符号标记之。 （二）适用于厌氧菌的方法 培养基： 蛋白胨 20g 氯化钠 5g 琼脂 1g 1.6％溴甲酚紫酒精溶液 1ml 糖 10g 硫乙醇酸钠 1g 蒸馏水 1000ml 将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于烧瓶内，加热使融化，再加入所需的糖，调整pH到7.0，加入指示剂，分装试管，在10磅高压灭菌15分钟后，做成高层。 方法 将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部，于37℃培养。结果观察同需氧菌。 二、V－P试验（二乙酰试验） 原理：某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）→2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。其反应式为： 2CH3COCOOH——→CH3COCHOHCH3十2CO2 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 CH3CHOHCHOHCH3 CH3COCOCH3 2，3-丁烯二醇 丁二酮（二乙酰） 培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5g，完全溶解于1000ml水中后，分装试管内，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。 方法： 1．O’Meara’s法 试剂：40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中，加入0.3g肌酐即成。 将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，于35～37℃培养48小时，于每毫升培养物中加入0.1ml，猛烈摇振混合。 2．Baritt’s法 试剂：6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。 同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。 试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应（长时间无反应，置室温过夜），次日不变者为阴性。 三、甲基红（M．R．）试验 原理：某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而不是生成V－P试验中的二乙酰，从而使培养基的pH下降至4.5或以下（V－P试验的培养物pH常在4.5以上），故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与V－P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。 培养基：同V－P试验培养基。 甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于300ml95％酒精中，再加入蒸馏水200ml。 方法：接种细菌于培养液中， 37℃培养2～7天后，于培养物中加入几滴试剂，变红色者为阳性反应。 四、淀粉水解试验 原理：细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类，在培养基上滴加碘液，可在菌落周围出现透明区。 淀粉琼脂培养基： pH7.6的肉浸汤琼脂 90ml 无菌羊血清（只对不易生长的细菌才加） 5ml 无菌3％淀粉溶液 10ml 将琼脂加热融化，冷却到45℃，加入淀粉溶液及羊血清，混匀后，倾注平板。 方法：将细菌划线接种于上述平板上，在37℃培养24小时。生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，观察。 结果：培养基呈深蓝色，能水解淀粉的细菌及其菌落