荧光原位杂交(FISH)介绍.ppt

寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重复序列的荧光原位杂交分析。 * 探针标记 为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。 荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进行标记。 探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方法。 * 对探针进行标记时，可复制合成一段新探针分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入，探针的信号强。 均匀标记有切口平移法、随机引物法和PCR扩增等方法。 均匀标记 * * 切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。 该方法使用时应注意： A.只能标记双链DNA 使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小 B. DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎，不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不能进入缺口 C. 标记时间不能太短 太短时间会造成标记量不足，影响杂交的进行 * * 1、不但可用于双连DNA的标记，而且可用于单连DNA和RNA的标记 2、操作简单 3、标记率高 * * 末端标记 直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子，或直接在探针分子上加上标记的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行，所以称之为末端标记。 经过末端标记的核酸分子除作为杂交探针外，更多的用于RNA S1作图以及引物延伸反应中的标记引物。 * * 染色体显带 显带染色是将染色体经过一定程序的处理,并用特定的染料染色后,使染色体在其长轴上显示出一个个明暗交替或深浅不同的横纹,这样的横纹就叫做染色体的带。 食管癌细胞系24色染色体mFISH核型分析 * 每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色体显带。 染色体显带为染色体的研究提供了一个十分有效的方法。 染色体的显带技术分为两大类:一类为整条染色体的显带技术；另一类为染色体局部的显带技术。 * * 奥芬兰海水硝化细菌荧光原位杂交 全菌（采用EUB MIX型探针） 氨氧化细菌（采用NSO1225型探针） 全菌（采用EUB MIX型探针） 亚硝酸盐氧化细菌（采用NIT3型探针） * 荧光原位杂交特点 优点 1、荧光试剂和探针经济、安全； 2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当； * 5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 * 缺点 1、不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 2、必须在已知探针的情况下方可进行。 * FISH技术新进展 随着FISH的广泛应用，FISH本身也得到长足进步。这主要表现在以下几个方面： 探针 由最初的每次杂交用一种探针发展为每次杂交用多种探针，即由单色荧光原位杂交发展为多色荧光原位杂交 标记物质 由单一的几种发展为现在的几十种 杂交步骤和过程 分别由20多步、15h缩减为不到10步、2h * 　 * 一、基因定位 二、物理图谱的构建 三、染色体结构分析与数目测定 四、物种起源、进化和亲缘关系研究 五、转基因的细胞学鉴定 六、基因表达分析和临床病毒学检测 荧光原位杂交的应用 * 荧光原位杂交的发展前景 FISH技术在遗传学研究中已经取得了不小的成绩，但是其深度与广度还不够，尤其与生产实践、经济效益的联系不够紧密。 随着标记手段、检测试剂、荧光观察等技术的发展,FISH 技术的应用范围在不断扩展, 今后该技术在研究细胞核骨架与基因表达的关系,基因转录、重排、扩增,基因组结构与调控,哺乳动物的染色体进化研究及亲缘关系等领域将会起到积极的作用。 * * 最常用的探针标记法是缺口平移法，其原理是：首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’的外切酶活性，切去带有5’磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性，使荧光素标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为荧