引物设计原理.pptxVIP

PCR引物设计原理PCR反应一般由三个步骤组成：① 模板的热变性；② 引物复性到单链模板上；③ 热稳定DNA聚合酶催化的延伸在应用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 时，变性温度在94-95℃下进行，这也是Taq DNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。有时把变性时间设计为 5min，以便大分子模板 DNA 彻底变性的概率。对于 GC 含量为 55% 或更低的线性 DNA 模板，推荐 PCR 的变性条件是 94-95℃ 变性45s。变性复性温度（退火温度）至关重要！！！退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增；退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低 3-5 ℃下进行。最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-10 ℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。引物和模板DNA 的复性对 Taq DNA 聚合酶来说，最适温度为72-78 ℃，时间约为1min。哺乳动物 DNA 为模板时，至少进行25个循环才能得到足够量的扩增产物。一般为30-33个循环。引物的延伸与循环数目引物设计要点（1）碱基组成：GC含量应在40%-60%（ 45%-55% ）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；（2）引物长度：引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。（3）重复或自身互补序列：形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。（4）上下引物的互补性：一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3末端都不能和 其他任何引物互补。（5）解链温度（Tm 值）：计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差不能大于10 ℃；引物的 Tm 值一般为50-70℃。这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环可有效变性。（6）3’末端3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大降低；当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般 PCR 反应中，引物3’末端的碱基最好选T、C、G，而不选A。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。？？（7）5’端序列添加限制性酶切位点：有意链（Sense strand），正义链（positive strand），编码链（coding strand）；无意链（anti-sense strand），负义链（negative strand），模板链（template strand） 一些概念正向引物 （forward primer）：处于DNA双链上游的引物。如用于测序，则从5’→3’方向读出 DNA正链的序列。反向引物 （Reverse primer）：处于目的DNA双链下游的引物。如用于测序，则读出 DNA负链从下游到上游的反向序列。 是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、primer design、酶切分析（restriction site）和 MotifPrimer Premier 5.0 软件设计引物正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reverse complemented ）。正向（As is）反向（reversed）互补（complemented）Enzyme软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq 或 Map，分别以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。Motif Primer点击 Search，进行引物搜索Primer Length常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。Search criteria 窗口：多