WB操作原理以及流程细节.doc

WB 实验的基本原理及操作流程 【实验原理 】 一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质 ( 或酶) 。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要 标志，检测蛋白质的方法很多， 除 ELISA 法 外，也可用与检测 DNA和 RNA相类似的吸印方法。 前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为 Western( 西) 印迹法，该法能用 SDS聚 丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专 一抗 血清结合的专一性蛋白质。 将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的 蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。 第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决 定簇结合，然后用另一种蛋自质，如 135I- 蛋白 A 或辣根过氧化物酶连接的山羊抗 IgG 检测 已结合上去的抗体。本法所需时间 6 小时或过夜。 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺 凝胶 上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单 个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。 最常用的方法是将强阴离子去污剂 SDS与某一还 原剂并用， 并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。 变性的多肽与 SDS结合并因此 而带负电荷， 由于多肽结合 SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关， 因此 SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下， 每克多肽约可结合 1.4 克去污剂， 借助已知分子量的标准参照物， 则可测算出多肽链的分子 量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的 pH 值与离子强 度不同于配胶缓冲液， 当两电极间接通电流后， 凝胶中形成移动界面， 并带动加入凝胶的样 品中所含的 SDS多肽复合物向前推进。 样品通过高度多孔性的积层胶后， 复合物在分离胶表 面聚集成一条很薄的区带 ( 或称积层 ) 。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩 于极小体积的能力，故大大提高了 SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornsstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的，样品和积 层胶中含 Tris-Cl(pH6.8) ，上下槽缓冲液含 Tris- 甘氨酸 (pH8.3) ，分离胶中含 Tris-Cl(pH8.8) 的。系统中所有组分都含有 0.1 ％的 SDS(Laemmli, 1970) ，样品和积层胶中 的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界， 在移动界面的两边界之间 是一电导较低而电位滴度较陡的区域， 它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚， 此处 pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之 后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后， SDS多肽复合物成一电位和 pH值均匀的区带泳 动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 【常用试剂】 1)30%丙烯酰胺/0.8% N,N ’ - 亚甲丙烯酰胺 将 30 克丙烯酰胺和 0.8 克 N,N’- 亚甲丙烯酰胺溶于总体积为 60ml 的水中 ，加热至 37℃溶 解之，补加水至终体积为 100ml。0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液 pH应不大于 7.0 ， 置棕色瓶中保存 。 小心： 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收， 其作用具有累积性。 称量丙烯酰胺 和 N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因 为它还可能含有少量未聚合材料。 2)4× Tris?Cl/SDS, pH8.8, 在 300mlH2O中溶解 91g Tris 碱(1.5mol/L) ，用 1mol/L 调节 pH至 8.8, 补加 H2O至体积 500ml。用 0.45um 滤膜过滤溶液，再加入 2g SDS[0.4%(w/v)] ，于 4℃可保存 1 月。 3)4× Tris?Cl/SDS, pH6.8, 在 40mlH2O中溶解 6.05g Tris 碱(0.5mol/L) ，用 1mol/L 调节 pH至 6.8, 补加 H2O至体积 100ml。用 0.45um 滤膜过滤溶液，再加入 0.4g SDS[0.4%(w/v)] ，于 4℃可保存 1 月。 4)4× SDS电泳缓冲液 Tris base 24.2 g Glycerin 115.3 g 20%SDS 20 ml 加水至总体积 1000ml。 应用时稀释 4 倍即为 1× SDS电泳缓冲液 (Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%) 。 5)TEMED (N,N,N’,N’ - 四甲基乙二胺 ) TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和 N,N’- 亚甲丙烯酰胺的聚合 。 6)10%过硫酸铵 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺