总RNA提取实验原理.doc

总RNA 提取实验原理、步骤和问题解答 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性，裂 解细胞并释放出 RNA, 酸性条件使 RNA 与 DNA 分离 ,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。 RNA 存 在于水样层中。收集上面的的水样层后， RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的 DNA ，在有机层中加入异丙醇能沉淀 出蛋白。共纯化 DNA对于样品间标准化 RNA 的产量十分有用。 无论是人、动物、 植物还是细菌组织， 各种样品最大使用量 （ 1ml Trizol ），动物组织( 50mg) ，植物组织(100 mg) ，丝状真菌 ( 100mg) ，动物细胞 (5×106 ～ 1×107) ，酵母 (1×107) 。 TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种 RNA 的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的 RNA琼脂糖 凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于 7 kb 和 15 kb 之间不连续的高分子量条带， （ mRNA 和 hnRNA 成分）两条优势核糖体 RNA 条带位于 ~5 kb (28S) 和 ~2 kb (18S) ，低分子量 RNA 介于 0.1 和 0.3 kb 之间 (tRNA, 5S) 。当抽提的 RNA 用 TE 稀释时其 A260/A280 比值≥ 1.8 。 [实验用品 ] 【实验耗材】 1、移液枪： 1ml、200 μl、20μl、 10μl、 2μl。酒精擦拭，头部重点，紫外线照射。 2、吸头： 1ml、200 μl、 20μl 3、匀浆管： 5ml 4、吸头台：放置 1ml 吸头的一个，放置 20 μl 吸头的一个 5、 EP 管： 1.5ml 、 0.2ml 、100 μl 6、试剂瓶： 2个 60ml 的棕色广口试剂瓶。青霉素小瓶（分装无水乙醇，高压的 DEPC 水，－ 20 °C 保存）。 7、量筒： 50ml 、 250ml 、500ml 8、容量瓶： 250ml 、500ml 、1000ml 9、试管架： 5ml、1.5ml 、 20μl 10、盐水瓶： 250ml 、500ml 各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装 DEPC 水 11、铝制饭盒： 4个 12、塑料小饭盒： 1个 13、大瓷缸： 2个 14、锡泊纸：一卷 15、卷纸： 2卷 16、三角烧瓶：带盖，稍大（融琼脂糖） 【实验仪器】 天平、振荡器、高速离心机、 0.5～10ul 、 20～200ul 、 100～ 1000ul 加样器。 【自备试剂】 DEPC( 焦碳酸二乙酯),氯仿，异丙醇，无水乙醇， 0.05 ～0.1 ％DEPC －H2O ，75％乙醇， TE缓冲液，琼脂 糖。 RNA 抽提的准备工作 【试剂配制】 1.DEPC 水： 1ml＋ 1000ml 双蒸水＝ 1‰ DEPC 水， 1000ml 容量瓶中静置 4小时。 2.75% 乙醇：无水乙醇 +DEPC 水， -20 ℃保存（ DEPC 水需先高压） 3.氯仿：棕色瓶 4.异丙醇：棕色瓶 【器具处理与准备】 1.塑料制品：（包括枪头、 EP 管、匀浆管等） 先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，小枪头需打入 DEPC 水，室温过夜，高 压，烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（ EP 管）。胶塞同样处理。塑料器皿也可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 2.玻璃制品： 泡酸过夜，冲洗干净， 1 ‰ DEPC 过夜，蒙锡纸， 150 °C 烘烤4h，180 °C，2h。或泡酸过夜，冲洗干净后 高温烘烤， 1 ‰ DEPC 过夜，高压。盛装乙醇， DEPC 水用。 3.匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡 DEPC ） [实验内容和方法 ] 一、抽提 （一）组织抽提 1.组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。实验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥发将粉 末转移到 EP 管，室温 5000rpm 离心去上清。每 50-100mg 组织，加入 1ml Trizol 。 2.若是新鲜标本经匀浆后转移离心管，加入 1ml Trizol 。 3.若组织量 (1～10 mg) 或细胞数很少 (102 ～104) ，在样品中加入 800 ul Trizol 反复抽吸均匀， 再加入糖原 (终 250ug/ml), 剧烈振荡或用匀浆器匀浆。 4.在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在 –60～70 °C 保存至少一个月。 （二）细胞抽提 1.倒掉培养基， PBS 洗，直接将 1ml Trizol 注入培养瓶（ 5×106 ），反复