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蛋白水解度(DH测定方法—OPA法 一、定义 水解度(DH是指蛋白质中被水解的肽键占总肽键的百分比。其基本计算公式如下: DH=被水解的肽键数 蛋白质总肽键数 ×100%= h htot ×100% h tot的值根据不同的底物蛋白会有所不同,h是用等价serine NH2表示的。 ?=Serine NH2?β α meqv/g protein 更多α,β,htot的精确数值请参见备注。 此处的DH是指样品相对于原始底物的水解度,如果要计算水解反应前后的水解度,需要使用如下公式: DH=h1?h0 htot ×100% h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度; h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。 二、原理 OPA(邻苯二甲醛法测定蛋白质水解度的原理是OPA在β-巯基乙醇的存在下会与自由α-氨基形成黄色化合物,其在340nm处有特征吸收,用分光光度计可检测其OD值。实际使用中1,4二巯基苏糖醇(DTT比β-巯基乙醇更易使用。 三、试剂 测试所需试剂及设备如下: 硼砂(CAS 1303-96-4 AR 十二烷基硫酸钠(SDS, CAS 151-21-3 AR 邻苯二甲醛(OPA,CAS 643-79-8,纯度97%(sigma 1,4-二巯基苏糖醇(DTT,CAS 3483-12-3,纯度99%(sigma 丝氨酸(serine标准品(CAS 302-84-1(sigma 紫外可见分光光度计(可测340nm吸光值 容量瓶100ml,200ml,500ml各数个 10ml测试管数个 3.1 OPA试剂 A1. 将7.620g硼砂(CAS 1303-96-4和200mg十二烷基硫酸钠(SDS溶解于150ml去离子水中。溶解完全后方可加入其他试剂。 A2. 将160mg邻苯二甲醛(OPA,纯度97%溶解于4ml无水乙醇中。溶解完全后将此OPA溶液转移至上述A1溶液中,并用去离子水冲洗,转移。 A3. 将176mg 1,4-二巯基苏糖醇(DTT,纯度99%加入到A1溶液中,去离子水冲洗,转移。 A4. 用去离子水将A1溶液定容至200ml. 此试剂现配现用。 3.2丝氨酸标准溶液 将50mg丝氨酸(serine溶解于500ml去离子水中。此溶液中Serine-NH2约为 0.9516 meqv/L. 3.3样品溶液 将Xg样品溶解于100ml去离子水中,X的值在0.1~1.0之间。 如果样品蛋白含量为80%,则X取0.1g,如果样品蛋白含量为8%,则X取1.0g。 *水解实验中可取100ul水解样品加入到900ul,5%(W/W热的(85℃SDS溶 液中,保温5min灭酶。样品保存在-18℃以备测试。计算时注意蛋白浓度的变化。 四、测试步骤 使用分光光度计测试所有样品的340nm吸光值,空白对照为去离子水。 1.加3ml OPA试剂到所有的测试管中。 分析一个样品所需的测试管: 标准溶液 4个 空白 4个 样品溶液 2×2个 每个样品须测2次,每次需有一个平行样,故需4个测试管。 2.标准溶液测试 将400ul丝氨酸标准溶液加入到一个装有3mlOPA试剂的测试管中(时间点0, 混合均匀(5S后精确静置2min后立即读取340nm的吸光值。 在测空白和样品值之前测2个标准品,另2个标准品在测完空白和样品后再测。标 准品的吸光值取4次的平均值。 一般情况下OD stand.≈0.8 3.空白测试 将400ul去离子水加入到一个装有3mlOPA试剂的测试管中(时间点0,混合均匀(5S后精确静置2min后立即读取340nm的吸光值。 测4次空白取平均值。一般情况下OD blank≈0.07。 *如果用5% SDS溶液取样灭酶,则空白就是5% SDS溶液。 4.样品测试 将400ul样品溶液加入到一个装有3mlOPA试剂的测试管中(时间点0,混合均匀(5S后精确静置2min后立即读取340nm的吸光值。 因为吸光值会随时间变化,所以读取OD值的时间必须是同样的(2min。 五、计算 5.1 计算h Serine NH2=ODsample?ODblank ODstand.?ODblank ?0.9516meqv/L?0.1?100 X?P L/gprotein Serine NH2meqv serine NH2/g protein X g sample (0.1~1.0g P protein % in sample 0.1sample volume in L h=Serine NH2?β α meqv/g protein 各底物的α和β具体数值见附表。 如果未对底物进行测试,α和β可按1.00和0.40粗略计算。 5.2 计算DH DH=?1??0 ?tot *100% h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度; h1: 水解反应后样