蛋白质含量的测定(Folin―酚法).docVIP

实验报告 实验名称:蛋白质含量的测定(Folin-酚法实验日期: 班级:学生姓名: 研究背景与目的:蛋白质是生物最重要的基本组成成份之一, 蛋白质的定量分析方法的研究在国际上一直十分活跃,Folin-酚法是一种灵敏度极高,可快速测定蛋白质含量的方法,广泛地应用于蛋白质含量的测定。 本实验培养掌握使用Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和操作方法,同时熟练722分光光度计的使用和比色法。 实验原理:Folin-试剂是由两部分组成,甲试剂相当于双缩脲试剂,在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜离子结合生成络合物。试剂乙是磷钨酸和磷钼酸的混合液,在碱性条件下极不稳定,易被蛋白质和试剂甲生成的络合物还原,生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应。 根据此试剂与蛋白质的反应以及一定条件下,兰色深度与蛋白的量成正比,可用比色法,使用分光光度计,通过对呈现蓝色的混合物进行浓度测定,再依据比例计算出蛋白质含量。 仪器与试剂:722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司 架盘天平 具塞刻度试管8支15ml 移液器100ul-1000ul和1ml-5ml 容量瓶50ml*1 小烧杯漏斗研钵 Folin酚试剂:试剂甲试剂乙 250ug/ml牛血清白蛋白标准原液 材料:绿豆芽下胚轴 实验步骤: 1.标准曲线的绘制 取6支15ml具塞刻度试管,编号。如下表所列加入相应试剂。 2.样品测定 (1称取绿豆芽下胚轴1g于研钵中,匀浆。转入50ml容量瓶中,定容。然后过滤, 滤液即为样品液。 (2取具塞刻度试管2支,编号8、9,分别加入滤液1ml,分别加入试剂甲5ml,混 匀后放置10分钟,然后各加入试剂乙0.5ml,迅速混匀,室温下放置半小时, 于650nm波长下比色,记录消光值,取其平均值完成计算。 数据整理与计算: 表1 Folin-酚法测蛋白质含量的标准曲线 图1 从标准曲线中查得样品的OD650平均值对应的蛋白质含量X(ug/ml=71ug/ml,然后按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。 样品中蛋白质含量(%=X(ug/ml*样品总体积(ml*100 样品重(g*106 将数据X(ug/ml=71ug/ml代入公式 样品中蛋白质含量(%=71*50*100/(1*106=0.355% 结果分析:经过本实验的数据计算,得到绿豆芽中蛋白质含量为0.355%,而网络上查得的绿豆芽中蛋白质含量为2.2%,与实验测得相差一个数量级,但是与其他实验组的同学讨论得知,所测得的含量都与我组所测的数量级相同。分析可知,豆芽的品种不同,生长所需要的条件和时间也不尽相同,所以与网络查得的数据比较价值很小,而与其他组比较可知我组数据相对准确。 参考文献:/view/e4ec35360b4c2e3f572763f6.html 《蛋白质含量的测定》 /life/class/biochemistry/Experimentation/Ex08.doc 《Folin—酚法测定血清蛋白质含量》 /view/499547a6f524ccbff1218488.html《蛋白质含量测定——福林酚法》 /blog/static/2041113420100209343510/《Folin—酚试剂法(Lowry法》 思考题: 1.为什么要求加入试剂乙后立即混匀?否则将会如何影响测定结果? 已知试剂乙未磷钨酸和磷钼酸混合液,乙试剂在酸性条件下较稳定,在碱性条件下极不稳定。又知Folin-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液,所以加入试剂乙后要立即混匀,以便在在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前,使还原反应发生。否则试剂乙含量减少,使得蛋白质与试剂甲作用后的溶液不能完全反应,以致所测蛋白质含量偏低。 2.试分析本实验方法中的干扰因素 本实验方法中从物质角度分析蛋白质中氨基酸的R基团中的酚类物质,豆芽中的柠檬酸、甘氨酸、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。从实验过程分析,反应的操作时间不易控制,如:加入试剂乙后迅速混匀等。 3.为什么测定同一类甚至同一种物质的含量会有多种测定方法? 每一种测量方法都有各自的特点,即各有各的优缺点,如:Bradford法和Lowry法灵敏度最高,定氮法更准确,但也更加复杂。因为某一种并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质含量测定,于是,我们在选择测量方法时,要考虑实验对测定所要求的灵敏度和精确度,蛋白质性质,溶液中存在的干扰因素,测定所要花费的时间等等方面。所以会有多种测定方法。 4.在Folin-酚法中,试剂甲的作用是什么? 试剂甲的作用是与蛋白质中的肽键形成络合物,使其可以还原磷钨酸和磷钼酸,另外试剂甲可以为试剂乙的反应提供一个碱性环境。 实验小结: 在这一次的实验中,我与同伴的配合更加默契。在预习本实验时,我对此次实验操作所预测的时间为80分钟