染菌的检查、分析和防止措施.docVIP

染菌的检查、原因分析和防止措施 ?1.染菌的检查与判断 ? 在发酵过程中对杂菌污染的及早发现，及时处理，是免除染菌造成严重损失的重要问题。因此，要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染，目前常用方法主要有以下几种： （1）显微镜检查 ??? 通常用革兰氏染色法，染色后在高倍显微镜下观察。对霉菌、酵母发酵，先用低倍显微镜观察生产菌的特征，然后再用高倍显微镜观察有否染菌存在，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢和鞭毛染色。 （2）平板划线培养或斜面培养检查法 ?? 先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏37度，保温24h检查无菌即可使用。将需要检查的样品，在无菌平板上划线，分别置摄氏37度、摄氏27度培养，以适应嗜中菌和低温菌的生长，一般在8h后即可观察。 ?? 噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并保持摄氏40度，加生产菌作为指示菌和待检样品混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经12~20h培养，观察有无噬菌斑。 ?培养基（PH7.0） ????????? 葡萄糖（%）牛肉膏（%）蛋白胨（%）氯化钠（%）琼脂（%） 上层????? 0.5?????????????? 1.0????????????? 1.0?????????????? 0.5?????????????? 1.0 下层????? 0.5?????????????? 1.0????????????? 1.0?????????????? 0.5???????????????2.0 （3）肉汤培养检查法 ??? 将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置摄氏37度和摄氏27度分别培养24h，进行观察，并取样镜检。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。 ?? 葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨0.8%，1%酚红溶液0.4%，PH7.2。 ??? 用以上的检查方法检查未发现污染，还不能肯定未被污染。 ?? 除以上方法外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、PH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。 2.发酵染菌率和染菌原因分析 （1）发酵染菌率 ?? 发酵的总染菌率是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。 ???发酵染菌是在发酵罐中发生的染菌率，包括染菌后被挽救不了导致倒罐的批数，但种子罐培养的染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。 （2）染菌原因分析 ??? 在发酵染菌之后，必须分析染菌原因，总结发酵染菌的经验教训，把发酵染菌消灭在发生之前，防患于未然，是积极制服发酵染菌的最重要措施。 ??? 造成发酵染菌的原因很多，但总结归纳起来，其主要原因有：无菌空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善。在发生染菌后，根据无菌试验结果，参考以下方法进行分析，找出原因，杜绝污染。 （A） ?? 从染菌时间来看，发酵早期染菌，可能原因有：种子带菌，培养基和设备灭菌不彻底，接种操作不当，无菌空气带菌；发酵后期染菌，可能原因有：中间补料污染，设备渗漏，操作问题。 （B） ?? 从污染的杂菌种类来看，污染耐热的芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底；污染球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌可能是种子带菌，设备渗漏；污染霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或操作问题。 （C） ? 从染菌的幅度来看，如果各个发酵罐或多个发酵罐染菌，而且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题；如果各别罐连续染菌，一般是设备问题。 ?? 以上仅仅是在分析问题时作为考虑问题的入门，应根据具体情况综合分析，且通过进一步的无菌检查来验证。 3.杂菌污染途径及预防 （1）种子带菌及防止 ?? 种子带菌的原因主要有以下几方面 ?（A）培养基及用具灭菌不彻底? ???? 菌种培养基及用具灭菌均在灭菌锅中进行，造成灭菌不彻底主要是灭菌时锅内空气排放不完全，造成假压，使灭菌时温度还达不到要求。 （B）菌种在移种过程中受污染 ?? 菌种的移接工作是在无菌室中，按无菌操作进行。当菌种移接操作不当，或无菌室管理不严，就可能引起污染。因此，要严格无菌室管理制度和严格按无菌操作接种，合理设计无菌室。 （C）菌种在培养过程或保藏过程中受污染 ?? 菌种在培养过程和保藏过程中，由于外界空气进入，也使杂菌进入而受污染。为了防止污染，试管的棉花塞应有一定的紧密度，不宜太松，且有一定长度，培养和保藏温度不宜变化太大。每一级种子培养物均应经过严格检查，确认未受污染才能使用。 （2）无菌空气带菌及防止 ?? 无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和