银屑病患者表皮角质形成细胞中神经生长因子及其受体的研究.doc

???? 银屑病患者表皮角质形成细胞中神经生长因子?及其受体的研究 ???? ????神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)是最早发现的神经营养多肽,它是外周和中枢神经系统某些感觉和交感神经元存活和分化所必需的[1]。大量研究表明NGF还是许多细胞的促分裂剂,对免疫系统及免疫应答调节也产生重要影响[2]。近期研究结果表明:角质形成细胞能合成、分泌NGF,自分泌和旁分泌的NGF能通过特异性结合角质形成细胞自身表达的高亲和力NGF受体(NGF－R)发挥作用,促进角质形成细胞增殖[3,4]。我们采用免疫组化技术原位检测了NGF及其受体在银屑病皮损、非皮损及正常人表皮角质形成细胞的表达情况,并对银屑病患者进行了分期研究,以探讨NGF及其受体与银屑病发病的关系。 　　一、材料和方法 　　(一)标本来源及制备:银屑病患者组17例,均为临床诊断明确的寻常型银屑病患者。其中进行期11例,静止期6例;男10例,女7例;年龄16～51岁;病程8个月到26年;皮损面积6％～50％;所有患者近1个月内未服用皮质类固醇及免疫抑制剂，也未接受其它系统治疗,无PUVA照射史,停局部治疗至少2周。正常对照组9例,其中男6例,女3例;年龄17～42岁。取材部位为腰背部及四肢。采用3～6mm环钻取材,取距皮损5cm以上外观正常的银屑病患者皮肤作为非皮损对照。正常人皮肤标本取自腰背部及四肢手术切口处。皮肤组织取下后立即用OCT包埋,液氮速冻后置－76℃冰箱保存。冰冻切片厚度为4～6μm,室温风干30min后密闭封存于－76℃冰箱中备用。　　主要试剂:兔抗人NGF多抗和兔抗人NGF－R(trk)多抗均来源于SantaCruzBiotechnologyInc。　　(二)免疫组化染色:采用链霉亲和素解放军总后勤部科研基金资助课题标记的碱性磷酸酶法(Strepta－AP)进行免疫组化染色,具体步骤如下:将冰冻切片从－76℃冰箱中取出,密封条件下依次复温,－20℃20min,－4℃20min,室温20min;3.33mol/L(10％)福尔马林溶液固定6min;PBS(0.01mol/L,pH7.2)洗涤5min×3次;放入湿盒,1％牛血清白蛋白(BSA)封闭10min,1∶10正常羊血清(NGS)封闭10min;吸去NGS,滴加1∶100稀释的一抗,室温孵育60min;PBS洗涤5min×3次;滴加羊抗兔抗体(GαR)(1∶50GαR、1∶10正常人血清),25℃室温30min;PBS洗涤5min×3次;滴加1∶100Strepta－AP复合物,室温30min;PBS洗涤后在0.2mol/LpH8.0Tris/HCl缓冲液中浸泡10min;滴加新品红底物显色液,避光显色30min;PBS浸泡10min,终止显色;苏木素复染,流水冲洗,封片。用PBS作阴性对照。结果判定:胞浆或胞膜出现品红色颗粒为染色阳性。　　(三)像分析及统计学处理:采用多功能彩色医学像分析系统,对表皮角质形成细胞免疫组化染色结果进行灰度定量分析,每张组织切片选取3个视野,测量灰度值,用单位面积内阳性面积的平均光密度和面密度来表示阳性染色颗粒的相对含量。　　统计学处理:两组数据间的差异采用配对t检验,3组数据间的差异采用方差分析。 表1　银屑病患者皮损及非皮损表皮中神经生长因子及其受全测定（0 (881 bytes) src=/med/cano/201003/20100317173350775 12 14±s） 组别 例数 神经生长因子 神经生长因子受全体 　 面密度 光密度 面密度 光密度 银屑病皮损 17 0.11±0.02* 0.19±0.04* 0.13±0.02* 0.18±0.05* 银屑病非皮损 17 0.05±0.02 0.08±0.02 0.09±0.01* 0.16±0.04 正常人 9 0.04±0.01 0.06±0.02 0.05±0.02 0.08±0.02 F值 　 0.52± 79.34± 69.44 15.10 P值 　 0.01 0.01 0.01 0.01 ???? 表2　进行期和静止期银屑病患者皮损及非皮损表皮中神经生长因及其受体测定（0 (881 bytes) src=/med/cano/201003/20100317173350775 12 14±s） 组别 例数 神经生长因子 神经生长因子受体 面密度 光密度 面密度 光密度 皮损处皮肤 　 　 　 　 　 进行期 11 0.12±0.02 0.20±0.03 0.14±0.02* 0.20±0.05* 静止期 6 0.09±0.02* 0.16±0.04 0.12±0.01 0.13±0.02 t值 　 2.89 2.53 2.44 3.08 P值 　 0.05 0.05