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测序常见问题分析 主讲人: 张隽辉 主讲人: 张隽辉 LOGO 1. 序列结构对测序的影响 图例：poly结构 原因: 主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上 滑动，导致随后的峰型变乱 或者移码 解决办法: 此类样品通过对其反向互补序列进行测序，通过 拼接可以得到模板全长序列. 图例：重复结构 原因: 重复结构会导致测序复制框的滑移，另外测序试剂采用 了I, U 代替G, T, 与模板结合能力较弱, 测序酶很难延伸, 信号会迅速衰减或峰谱很乱 解决办法： 使用反向引物对模板进行测序，测到重复序列反向互 补位置时，即可完成模板全长的拼接,一般测A\C重复 序列比G\T要容易一些 图例：回文结构 位点94至137碱基前后互补, 形成回文结构，该结构导致 后面的信号衰减，出现错误的判读。 图例: 特殊结构 现象: 信号在73bp （信号峰图2700处）突然中断， 测序PCR反应终止 原因: 变性后的单链在该处很可能互补或在全序列中有大的 特殊结构，造成严重的二级结构，使dNTP 和 ddNTP不 能和模板结合, 测序酶无法正常延伸 解决方法: 酶切,做亚克隆测序 2.测序常见图谱分析 图例:双克隆1 现象: T载体序列峰图正常, 连接位置处出现套峰 原因: 1.有插入片段的载体和空载体同时存在 2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向 插入T载体 解决办法： 重新挑取单克隆 备注: 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段， 并不足以证明模板的单一 图例:双克隆2 现象: 载体序列及插入片段前半部分峰图单一,套峰出现在插入片段中间 原因: 1. pcr产物不纯,且产物的引物结合区以及峰图单一的序列 都一样 2. 部分模板碱基发生突变,双峰出现的位点是由碱基突变 的位置决定的,有时会一端正常一端双峰(插入片断超过一 个反应测序长度(800~900bp)), 或者两个反应都双峰 解决方法: 重新挑单克隆 图例:非特异扩增 现象: 峰图起始即双峰 原因及解决方法: 1. 对于质粒样品, 引物在序列上有两个结合位点(载体上 和插入片段上),换一个引物测序 2.对于PCR产物,有两个模板,且两个模板都能和引物结合 扩增, 换引物或克隆测序 图例:等位基因双模板 现象:序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，没有发生移码突变 解决方法: 采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序 图例：碱基缺失 碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段， 上图的186位缺失两个连续的T 。 解决方法： 1)使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目 的。或者将该PCR产物克隆到质粒中，挑取单克隆测序。 2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可 以改变PCR反应条件，重新扩增。 图例:PCR产物有小片段 在197bp前表现为明显的套峰，且在197bp位置有一个高高的A 峰，这个A峰是测序进行到片段最后一个碱基的标志, 推断出产物 中有一个大小约为220bp左右的片段。 解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。 图例: 引物不纯 现象: 杂峰非常有规律,每个主峰下的小峰都是后一个碱基的主峰 原因: 部分引物比正常的引物在5’端少一个碱基, 导致移码双峰 解决方法： 重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测 序。 图例：染料峰 不合格 图例：染料峰 可认为合格 图例：残留盐分过高 Raw data峰 图例：残留盐分过高 sequencing峰