果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素.pptVIP

果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量 主要内容 1.背景知识介绍 RNAi(RNA interference)是一种基因阻断技术，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。 植物的转基因研究表明：导入含有内含子的能转录成双链RNA的DNA片段的反向重复序列能实现特异基因的完全沉默。 RNAi的发现 RNAi的发现 Dicer is a member of the RNase III family of nucleases that specifically cleave double-stranded RNAs. Dicer processes long dsRNA into siRNA of 21-23 nt. Small Interfering RNA (siRNA) is 21-23 nt double-strand RNA. It guides the cleavage and degradation of its cognate RNA. RNA-Induced Silencing Complex (RISC) is an siRNA-directed endonuclease, catalyzing cleavage of a single phosphodiester bond on the RNA target. RNAi分子机制 RNAi分子机制图 2.试验的目的及意义 3.实验材料和方法 实验方法 TA克隆获得重组载体pMD-Lcy、pMD-Pds 实验方法 转化 3.2番茄Pds启动子及Lcy片段的克隆 以番茄植株的幼叶为材料，采用CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法提取番茄基因组DNA。 根据 GenBank中番茄的Pds启动子序列设计特引物 P1:5′GAG CAG GTAAAA GCTTCAATG CCCTA 3′ P2:5′GTG CAGAAC CAC TCC CTATAT CTT CT 3′ 以番茄DNA进行PCR扩增。 3.2番茄Pds启动子及Lcy片段的克隆 3.2番茄Pds启动子及Lcy片段的克隆 同时，根据 GenBank中番茄的LcyB (X86452)和LcyE(Y14387 )基因序列设计同源引物 P3:5′CTATGG TGTTTG GGT GGATG 3′ P4:5′GTGCTC GATGCAACTGGCTTCTCTA3′ 以番茄DNA进行PCR扩增。 3.2番茄Pds启动子及Lcy片段的克隆 琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，做TA克隆，PCR鉴定获得重组载体pMD-Lcy、pMD-Pds。 设计特异引物从pCAMBIA1 301表达载体的GUS基因分离内含子片段。 3.3载体构建 载体pVCT-RNAi 转化 3.4番茄子叶的遗传转化 番茄种子 接种于1/2 MS培养基上 无菌苗的子叶于分化培养基 重悬农杆菌浸染预培养后的子叶8~10min 接到分化培养基上 3.4番茄子叶的遗传转化 转入抑菌培养基 转到选择培养基，进行抗性筛选 抗性芽(2~3cm) 插入到生根培养基 生根(3~4cm)后的植株开瓶炼苗 移栽到大棚中让其自然生长直到结果 3.5转基因植株的检测 PCR检测：提取卡那霉素抗性植株及非转基因 植株(阴性对照)的总DNA,进行PCR检测。 PCR：用P3单引物进行扩增,反应体系同扩增Lcy片段一样。 3.6番茄红素的测定 完全红熟的番茄果实(每株2个)研磨成糊 10g (每株)番茄糊,加入适量的氯仿 下层液体至一新的50mL的离心管中, 向番茄残渣中再加入适量氯仿抽提 U-1800紫外分光光度计在502nm波长下 测定番茄红素含量,制作标准曲线 4.实验结果4.1番茄Pds启动子及Lcy片段的克隆及序列测定 根据所设计的特异引物从番茄基因组中分别获 得了长302bp的Lcy片段(图1)和长1790bp的Pds启动子片段(图2),同时从pCAMBIA1301载体中的GUS基因中分离了一段内含子片段。测序结果表明所扩增的片段与GenBank中所发表的序列一样。 4.2 转基因植株的检测 通过抗性筛选获得了7株转化再生植株,分别提取这7株植株的DNA进行PCR检测,其中5株扩增出了预期的和质粒(阳性对照)中扩增的一样的片段,而阴性对照没有出现此带(图3),表明外源基因已经整合到了番茄基因组中。 4.2 转基因植株的检测 4.2 转基因植株的检测 将PCR鉴定为转基因的植株炼苗后,移载到大棚中让其自然生长直到结果,获得了转基因番茄果实