鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验.pptVIP

安全措施与废弃物处理 应有专门的实验室，应有良好的通风设备。 试验者必须注意个人防护，尽量减少接触污染的机会。 受试的致癌物与致突变物的废弃处理，原则上按放射性核素废弃物处理方法进行。 所用沙门氏菌试验菌株一般毒性较低，具有R因子的危害更小，但要防止沙门菌污染动物饲养室。 * Company name 毒理学基础实验课 LOGO 毒理学基础实验课 毒理学基础实验课 鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验 Ames test 公共卫生学院卫生毒理教研室 高淑英 原 理 鼠伤寒沙门氏菌 野生型（原养型） 人工方法正向诱变 鼠伤寒沙门氏菌 组氨酸缺陷型（异养型） 诱变物作用回复突变 Ames是检测遗传毒理学的体外试验，检测终点是基因突变 TA1537 TA1538 TA1535 R因子 R因子 R因子 TA97 TA98 TA100 TA102 移码突变 碱基置换突变 移码突变、碱基置换突变 实验菌株 深粗糙（rfa）特性 2 紫外线敏感（UvrB）特性 3 抗氨苄青霉素（R因子）特性 4 自发回变特性 5 组氨酸需求特性 1 菌株特性鉴定 1、组氨酸需求特性 有细菌生长 空白 空白 组氨酸-生物素 赖氨酸 空白 37℃ 24h 0.1ml菌液 顶层 底层 菌株特性鉴定 2、深粗糙（rfa）特性 0.1ml菌液 顶层 普通培养基 抑菌环 滤纸片（有结晶紫） 37℃24h 菌株特性鉴定 3、紫外线敏感特性 普通培养基 15W紫外灯 33cm，8s 37℃，24h 菌株特性鉴定 4、抗氨卞青霉素（R因子）特性 37℃，24h 青霉素 普通培养基 菌株特性鉴定 5、自然回变特性 0.1ml菌液 顶层 底层 37℃，24h 菌株特性鉴定 240-320 + - + + + TA102 120-200 + - + + + TA100 30-50 + - + + + TA98 90-180 + - + + + TA97 自发回变 （-S9） uvrB修 复缺陷 抗四环素 抗氨卞西林 脂多糖 屏蔽缺失 组氨酸缺陷 基因型 菌株 Ames试验菌株特性 实验设计原则 受试物最低剂量为每皿0.1μg 一般选用4~5个剂量 每个剂量应做2或3个平行平皿 设立阳性对照和阴性（溶剂）对照 受试物最高剂量为每皿5mg Ames试验设计 点试法 将顶层培养基倒入底层培养基中，凝固后放入滤纸片，将受试物点在纸片上放入底层，37℃培养48h观察结果 掺入法 将受试物0.1ml、菌液0.1ml分别加入顶层培养基中，倒入底层培养基中，凝固后37℃培养48h观察结果 Ames试验方法及结果评价 点样纸片周围长出一圈密集的His+回变菌落者，受试物即为阳性致突变物质。 背景菌生长良好受试物每皿回变菌落数增加一倍以上并有剂量-反应关系，试验结果具有重现性即可认为该受试物为诱变阳性。 S-9混合液的制备过程 2 5 3 4 1 暴露肝脏，KCL灌注 断头处死大鼠、放血、去皮 取出肝脏，加入KCL剪碎 制成匀浆，9000g离心 取上清、分装、冻存 S-9混合液的组成成分 肝匀浆S-9 100 μl 0.4mol/L MgCl2 20 μl 1.66mol/LKCl 20 μl 0.05mol/L 6-磷酸葡萄糖 100 μl 0.025mol/L 辅酶Ⅱ(NADPH) 160 μl 0.2mol/L 磷酸缓冲液 500 μl 加灭菌水 至 1ml 制作人：高淑英 联系电话：0451E-mail:gaoshuying2000@163.com