第5七章微生物的生长及纯培养.pptVIP

第七章 微生物的生长繁殖 大型真核生物生长 质量、高度的增加 微生物类似 诸多反应产能、合成代谢 细胞自身物质的增加 各种亚单位的组装（DNA、核糖体、细胞壁等等 质量、体积 微生物的生长 个体、群体 个体生长 个体繁殖 群体生长 群体生长 个体生长 + 个体繁殖 由于微生物的个体极小、生命周期短，实际中更有意义的生长指群体生长，也就是细胞数目的增加。 = 第一节 微生物纯培养 一、 微生物纯培养分离方法 微生物的分离 ? 微生物分离的环境 无菌技术 微生物的特点： 分布广泛、繁殖迅速、所需条件简单 （目标微生物＋其他微生物）均非常容易在营养基质上生长 微生物研究及生产中，防止其他微生物污染 无菌技术 器具（三角瓶、移液管、平皿、试管等） 设备（发酵罐等） 接种环、接种钩、接种铲 无菌箱、超净工作台 空间 隔离衣 棉塞、纱布 消毒剂 火焰（酒精灯、煤气喷灯等） 培养基 主要手段有： 高压蒸汽灭菌 高温干热灭菌 甲醛熏蒸 紫外线 75％乙醇 火焰烧灼 空气过滤 等等 移液管的包扎 p216 吸口端塞入少许脱脂棉 棉塞的制作 棉塞：防止杂菌污染，并保证通气良好 棉塞优劣对实验结果有很大影响： 形状、大小、松紧合适 棉花：纤维长的较好。不用脱脂棉（纤维间孔隙大，过滤除菌效果差；易吸水变湿，造成污染；价格较高） 牛皮纸、报纸、锡箔纸 功能：防止灭菌后棉塞遇冷，空气中微生物进入棉塞内部，造成棉塞污染；防止湿热灭菌时蒸汽打湿棉塞 无菌环境 1）火焰中上部无菌区 2）超净工作台、无菌室 3）过滤空气 棉塞、多层纱布等 无菌环境 PIII 无菌操作 Movie 1－4 无菌操作 平皿划线分离法 方法 稀释分离法 单细胞挑取法 1.稀释法 2.平皿划线法 Movie 1－6 3. 单细胞挑取法 采用显微操作仪，用毛细吸管或显微针挑取单个细胞或孢子，进而培养 4.利用选择培养基分离法 二、 微生物生长量的测定 生长测定的重要性 微生物群体生长规律、动力学特征； 微生物细胞成分分析、生理生化特征； 微生物的培养和管理。 微生物不同、方法也不同 相应的生长测定方法 单细胞（裂殖、芽殖） 直接法（测定细胞数目）、间接法（测定细胞质量或细胞组分） 多细胞 测定菌丝生长的长度或菌丝的质量 群体增长量 一、测定微生物总数 显微计数法 电子计数器法 比浊法 1）显微计数法 血球计数板——常用做酵母菌计数 1）显微计数法 血球计数板 1）显微计数法 血球计数板 样品稀释每个计数小室里5个细胞左右 原始样品106/ml则不适合应用 1）显微计数法 血球计数板 优点：简便快速 缺点：死活均计，即使借助美蓝染色区分死活菌，离真实活菌数也有差异。 2）电子计数器法 又叫电阻法。 菌体通过小孔，电阻变化，引起脉冲，记录，吸入培养液体积一定，因而脉冲数与菌体数目成正比。 优点：简便快捷 缺点：需特殊设备，对链状菌、丝状菌、含颗粒杂质培养液不适用。 5）电子计数器法 3）比浊法 菌悬液：颗粒对光的散射与吸收 一定浓度范围内，细胞数量与光密度成正比 3）比浊法 分光光度计 选取一定波长（400～700nm），像E.coli，580～620nm，注意排除培养液组分的影响 光电比浊计 常用于发酵生产过程菌体生长的监测，可以连续测定，简便快速。但如果培养液含有其他颗粒物或色素则不能使用 平板菌落计数法 活体计数 如实反映样品活体数目 二、测定活细菌数 平板菌落计数法 要求：稀释均匀，涂布充分（涂布法）或混合均匀（倾注法） 计数：每个菌落来自一个细胞，以每个平板30～300个菌落为宜（9cm平皿） 结果：稀释度 x 平均菌落数 ＝ ??CFU/ml 广泛应用于教学、科研、食品检验、以及其他众多样品中活菌检验 要求熟练掌握 薄膜过滤计数法 样品 薄膜过滤收集 培养 计数 三 间接测定法 测定细胞干重 测定生理指标法 营养基质的消耗 代谢产物含量 发酵液粘度 发酵发热量 发酵液酸碱度 1）测定细胞干重 单细胞、多细胞均适用，含杂质颗粒的培养物除外 液体培养  离心或过滤  洗涤除去培养基成分 烘干至恒重  称重 2）测定某种营养基质的消耗 选取标准：营养基质的消耗与菌体生长成正比，常为不可用于合成代谢的营养物。 步骤：测定营养基质消耗后，与标准曲线比对，估算菌体量 3）测定某种代谢产物的含量 选取标准：代谢产物含量与菌体生长成正比 例如，CO2作为有氧发酵的代谢产物，可依据CO2量估算细胞生长。全自动发酵罐中采用红外线气体分析仪来测定CO2的含量 4）发酵液粘度 依据：菌体生长、代谢产物积累使发酵液粘度增加 5）发酵放热量 依据：菌体生长释放热