(修改)实验四 Hb的醋酸纤维薄膜电泳与血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳.pptVIP

高脂蛋白血症的分型： CM β 前β α 正常 Ⅰ型 Ⅱa型 Ⅱb型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型 六.思考题 (Questions) 简述血浆脂蛋白的分类、组成以及生理功能。 * 实验四 电泳技术 Hb醋酸纤维薄膜碱性电泳与血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 背景知识 电泳：指带电胶体粒子或分子在电场的作用下，作定向移动。 由于各种物质分子的等电点不同、分子量、分子结构不同，形状大小各有差异，所以在同一PＨ环境中所带的电荷量各有不同，因此在同一电场中泳动速度也就不同。一般来说，所带的电荷多而分子量、形状小者，泳动速度快，反之则慢。 电泳技术的分类：目前主要归纳为； 1）显微电泳——即在显微镜下观察胶体粒子或细胞的移动度，也称细胞电泳。 2）自由电泳——即悬浮在介质中的细胞和生物大分子，在有电场作用下自由定向移动。 3）区域电泳（区带电泳）：即在不同电力条件、支持物上进行直接分离，鉴定生物物质，促使获得各自电荷差异的生物粒子或分子形成各自区域以帯形停留在载体上。如：滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等，此类 电泳技术分离技巧简便，运用十分广泛。 4）免疫电泳：即抗原与抗体在比例合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免疫技术，亲和电泳即属此类。。 根据缓冲液的性质不同可分为： 1.连续系统：电泳缓冲液的离子成分、PH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。 2.不连续系统：电泳缓冲液离子成分、pH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相同，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。 Hb醋酸纤维薄膜碱性电泳  一.实验目的 （Experimental Objectives）： 1.掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作 2. 了解血红蛋白的组成及分类 血红蛋白（Hb) 的组成及分类： 血红蛋白（Hb)：由亚铁血红素、珠蛋白 组成 。每个珠蛋白分子由4条多肽链构成 ，根据其一级结构的不同可分为α、β、γ、δ四种类型。 正常成人Hb种类： 组成 百分含量 pI HbA α2β2 95~98% 6.95 HbA2 α2δ2 2~3% 7.38 HbF α2γ2 1% 6.95 二、实验原理 (Experimental Principles) 在PH8.6的环境中，Hb是一种带负电荷的蛋白质（Hb的pI 〈 8.6） ，因此，与醋酸纤维薄膜作支持物，在电场中Hb向阳极泳动。电泳时，由于各种Hb所带电荷的不同，造成各自的泳动速度不同，因而被分离。这种分离可初步鉴定不同的Hb。 醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所有生物活性物质均能通过电泳作用得到分离。 醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分离清晰、无拖尾、易定量等，已成为临床、实验室首选的方法。 三、操作步骤（Operating Procedure） 1.取血：用碘伏及75%酒精棉球消毒手指尖，采血针穿刺,取血约0.05ml放入1.5mlEP管中，并轻轻摇匀。 2.制备Hb液： 1）洗涤红细胞：加0.9%NaCl 1 ml于上述管中，颠倒混匀5-6次，3000rpm/分，离心3分钟，弃上清液。重复以上操作一次。 2）溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水2滴，摇匀，再加入CCl42滴，充分摇匀， 4000rpm/分，离心3分钟,取上清液备用。 3. 电泳 1）膜条准备：提前2小时把膜条浸泡在浸膜缓冲液中待用。 2）点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在滤纸上（毛面朝上），用小玻片沾取适量Hb液，按印于点样线上。 3）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。膜条点样面向下，光滑面向上。点样的一端靠近负极。用浸泡在缓冲液中的纱布分别盖住膜条的两端，使膜条两端与缓冲液相连。盖严电泳室，通电，平衡5-10分钟，调节电压为100V，电泳30分钟。 4）染色：电泳完毕后将膜条取下并放在丽