核酸分子杂交技术要点.pptVIP

核酸分子杂交 Section I 核酸分子杂交技术的基本原理 有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe), 与变性后的单链DNA或RNA进行杂交。 再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。 第 二 节 一、Southern Blot 毛细转移 真空转移 电转移 二、Northern Blot 四、 斑点及狭缝杂交 五、原位杂交 （in situ hybridization） 第 三 节 生物芯片 第 四 节 一、 合成寡核苷酸探针注意原则 (1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。 (1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。 2 、标记物的种类 32P、35S、3H、125I等 第 五 节 影响杂交的因素 蛋白质芯片(protein chip) 抗原芯片原理图 探针的制备与标记 核酸探针 （ probe ）： 探针是指带有检测标记的，能与被检测核苷酸片段互补的一段已知核苷酸片段。 cDNA探针 基因组DNA探针 寡核苷酸探针 RNA探针 探针的种类： 二、 标记物 1 、 一个理想的标记物应满足： 半抗原：生物素（biotin） 、地高辛（Dig） 荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC） 、罗丹明等 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等 化学发光探针：增强鲁米诺发光体系、吖啶类化合物发光体系和碱性 磷酸酶催化的1，2-二氧环己烷发光体系 非核素标记物 核素标记物 体 内 标 记 体 外 标 记 化 学 法 酶 法 三、标记方法 缺口平移法 随机引物标记法 PCR标记法 末端标记法 利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团（如磷酸基团）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。 化学法： 多聚体乙撑亚胺 聚苯醌 酶（如HRP） 交联 多聚体乙撑亚胺 酶 DNA 戊二醛 交联 酶 法： OH 5 5 3 32P- dATP 生物素- dUTP orNTP 地高辛- dUTP orNTP 荧光素- dNTP DNase I 5 5 3 3 5 5 3 3 DNA聚合酶Ⅰ5-3外切酶活力 5 5 3 3 DNA聚合酶Ⅰ 5-3聚合酶活力 5 5 3 3 （一）缺口平移法 α- 32PdATP 5 3 5 5 3 3 5 3 3 5 5 3 模板 变性 合成标记 Klenow酶 （二）随机引物法 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样，标记的dNTP就可在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。 dCTP dGTP dTTP dATP α- 32- 5 3 5 3 底 物 引物 模 板 （三） PCR标记法 只将标记物标记在DNA链的3末端和5末端的方法称为末端标记。 3端DNA末端标记 5端DNA末端标记 （四） 末端标记法 3端DNA末端标记 T4噬菌体多苷酸激酶 5端DNA末端标记 γ- 32PdATP 先用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’末端的磷酸基团，使其成为5’-OH 1．乙醇沉淀法 2．Sephadex G-50柱层析法 3．微柱离心法 四、 探针的纯化 影响核酸分子杂交的基本因素 核酸分子的浓度和长度： 50～300 bp, 0.1～0.5 ?g 2. 温度: Tm-25℃ 3. 离子强度: Na+浓度约为1 mol/L 4. 杂交液中的甲酰胺: 50%甲酰胺,降低Tm 5. 核酸分子的复杂性 6. 非特异性杂交反应: 封闭 2000 1000 500 250 100 750 1 2 1： DNA marker 2：实验组（EcoR I） 0.8 ~ 1％ 非变性琼脂糖凝胶 （二）待测DNA样品的电泳分离 碱变性：DNA原位变性，形成单链分子， 以便进行分子杂交。 酸中和：凝胶pH值恢复中性， 以便DNA片段转移。 （三）凝胶中核酸的变性 （四）South