八章园艺植物生物技术4课件教学内容.pptVIP

园艺植物生物技术;主要内容;第一节 文库筛选;一、园艺植物基因组文库的构建;一、园艺植物基因组文库的构建;2. 载体的选择 a)质粒载体可承载15kb DNA左右片段(有效范围为?10kb) b)?载体可承载25kb DNA左右片段(有效范围为?15kb) c)Cosmid载体可承载45kb DNA左右片段(有效范围为?40kb);3.载体制备 要求:纯度高,去磷酸效果好 去磷酸化是为了提高载体和目标片段的连接效率 纯度如果不高则会在重组克隆中含有大量的细菌基因组DNA,影响文库的质量.;(四) 大片段基因组DNA的制备 要求:一般提取的DNA相对分子量至???应该是文库最终平均插入片段长度的3-5倍 如插入片段达到100kb以上,则要求提取的基因组DNA 分子量要达到500kb以上 实践证明:提取的基因组DNA分子量越大,得到的重组克隆的插入片段越大;基因组DNA 的不完全酶切 1. 根据实验需要选择合择的限制性内切酶 1) 四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256 2) 六个识别位点的限制酶出现的几率:1/4096 2. 分离目的酶切片段大小的确定 1)克隆单个基因:?10kb 2)克隆基因族:?20kb;基因组DNA 的不完全酶切 3. DNA不完全酶切条件的确定 1) 确定限制酶用量,改变酶切时间 2) 固定酶切时间,改变限制酶的用量;DNA的不完全酶切;(五)大片段DN