这就是多株抗体PolyclonalAntibody.ppt

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay免 疫 酵 素 連 結 反 應 ELISA的概念 抗原抗體間的專一結合關係 原理與免疫染色法類似，是利用抗體的專一性去偵測抗原量的多寡，並以酵素為放大信息的標示，因此有相當高的靈敏度；因為使用固相，故操作較為方便，同時可處理大量樣本，但解析力不及電泳轉印的免疫染色法。 ELISA的起源 1959年由Berson and Yellow基於生物分子抗原性，利用抗原抗體反應的專一性和高靈敏度來作生物分子的定量，並提出放射免疫分析(Radio-immunoassay, RIA)技術與理論。 1967年Catt和Tregear等人首先提出以抗體吸附在塑膠管內壁來進行固定相放射免疫分析的理論，以便游離態與結合態的分離。 背景理論 免疫反應 抗體 抗體由四條蛋白質長短鍊所組成 抗體分子上有兩個抗原結合區 抗體與抗原結合是專一性的 抗原決定位Epitope 一個抗原分子上可能有數個抗原決定位 每個抗原決定位至少誘發一種專一性抗體 蛋白質性抗原決定位含有六個以上胺基酸 一個B細胞只能生產一種抗體，對付某一 抗原決定位。 若有許多抗原決定位，則需許多個B細胞分別生產許多抗體。 抗原的種類 蛋白質 人工合成胜肽 小分子 稱為半抗原Hapten，需要和大分子的蛋白質載體Carrier螯合，方得進行免疫。 小分子抗原的製備 載體的選擇 Bovine Serum Albumin, Human Serum Albumin, Ovalbumin, Keyhole Limipt Hemocyanine等。 螯合方法 去除未結合部份 透析 螯合方法Conjugate Method Glutaraldehyde (GA) Method Carbodiimide (CD) Method Mixed Anhydride Method GA Method CD Method 免疫流程 免疫 免疫動物 兔,鼠,雞,羊等 免疫部位 皮下,肌肉,脾內 佐劑 完全佐劑和不完全佐劑 次數 取得抗體 處理 儲存 多株抗體vs.單株抗體 同一個抗原決定位，可有不同的B細胞反應，因此產生不同程度親和力的抗體。或一個抗原有不同的抗原決定位，因此對一個抗原，可以有一群抗體認識它，這些抗體的親和力不一樣，所結合的抗原決定位也可以不一樣，但都對這大抗原能結合，這就是多株抗體Polyclonal Antibody。 單株抗體Monoclonal Antibody是透過細胞融合技術，可以使一個B細胞變成一個融合瘤hybridoma，並使其單株化monoclonal，再篩選產生高親和力的抗體，因此單株抗體是均質性的(homogeneous)。 單株抗體只要細胞株存在，就可以一直生產該抗體，可以視為一種固定的試劑，不會隨著個體不同而有變化。 單株抗體只含有一種抗體，無法與抗原產生免疫沈澱。 單株抗體與抗原的結合部位通常只有一處，因此整體的結合力量可能不如多株抗體。 單株抗體的專一性較好，且可控制所要對抗的抗原決定基位置。 多株抗體 單株抗體 細胞融合Cell Fusion 此關鍵技術是 1980 年代，由 Kohler 與 Milstein 兩位科學家在英國劍橋大學所研發，往後數十年無論在基礎研究或醫學應用上都有很大貢獻，也一起獲得諾貝爾獎 (1984 年)。 B 細胞與骨髓癌細胞融合的方法。因為一般的 B 細胞無法在培養皿中活太久，因此不能如上述大量培養 B 細胞；而骨髓癌是一種淋巴癌細胞，與 B 細胞的背景相似，並且可以在培養皿中永久繼代下去，具有長生不死的特性。若將這兩種細胞混合，並以化學試劑 PEG (polyethylene glycol) 誘導其相互融合，兩組染色體混合之後可能產生重組，當細胞分裂數次之後，染色體數目回復正常，將可能有子代細胞同時兼具分泌抗體及長生不死兩種特性，稱為融合瘤 (hybridoma)。 純化抗體 硫酸銨Ammonium Sulfate沉澱 收集約 40% 飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。 離子交換 用 DEAE 陰離子交換法，多用在純化 IgG。 膠體過濾法 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化 IgM。 親和層析法 以 Protein A專一性地吸住IgG。 其他產生抗體的技術 選擇目標蛋白質上具有較強抗原性的一個片段，再以人工方法合成出這條胜肽後，接到carrier，然後免疫產生多株抗體。因為只會對抗一段很短的蛋白質片段，有點類似單株抗體對抗抗原決定基的高度專一性，特稱之為單專一性抗體 (monospecific Ab)。 噬菌體表現 (phage display) 取代傳統的細胞融合方