《报告基因和荧光淬灭》.ppt

报告基因技术和荧光淬灭技术; 1962年，下村修和约翰森从维多利亚多管水母（Aequoreavictoria）中分离生物发光蛋白-水母素（aequorin）时，意外地得到了一个副产物。它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。; 1974年，他们得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白（GFP）。GFP在水母中之所以能发光，是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。; 直到1992年，道格拉斯?普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP，文章发表在《Gene》杂志上。但具有讽刺意味的是，基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义，不愿提供经费。普瑞舍一气之下，离开了科学界，将GFP的cDNA送给了几个实验室。 ; GFP的结构以及发光原理，要到1990年代通过X光衍射才得到证实：GFP的肽链构成一个桶状结构，在其中心由3个氨基酸携带的芳香集团构成了发光核心结构。 但克隆并在真核细胞表达很长时间没成功 ; 随后哥伦比亚大学的 Martin Chalfie 就考虑只用它的编码区域来表达。他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，通过UV或蓝光激发，在大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破，文章发表在《Science》杂志上。证明从水母上分离出来的GFP基因可以在其它物种上表达，正确地折叠，发出荧光。这些研究成果为GFP在生物学研究上的使用，奠定了基础。 ; 钱永健的贡献，是利用他在活体荧光研究方面的丰富经验，对GFP进行改造，他的实验室利用定点突变改造出来 EGFP，不仅提高了荧光强度，更重要的可以在普通的荧光显微镜下用现有的荧光滤镜观察到，而且光谱单一，不会和其它荧光染料的光谱发生干扰。接着他的实验室又陆续推出了不同颜色的 GFP，如蓝色(BFP)和黃色(YFP)的荧光蛋白。这为同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构打下了基础 ;用途： 1、构建融合表达质粒 N端、C端 定位，形成融合蛋白，观察细胞内蛋白质分子动态变化(pEGFP-C1,pEGFP-N1,Clontech) 2、转基因研究， 筛选转化细胞，追踪外源基因 3、判断蛋白质分子的相互作用和距离（FRET） ;检测方法： 紫外灯 荧光显微镜 激光共聚焦显微镜 荧光激活的细胞分拣器（FACS）;FRET，即荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,) 随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。 原理：荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的 一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。 ;GFP由11个β片层组成桶状构成疏水中心，由α螺旋包含着的发光基团位于其中。这个发光基团(chromophore)是由3个氨基酸（Ser65、Tyr66、Gly67）经过环化、氧化后形成的咪唑环，在钙离子激发下产生绿色荧光。野生型GFP吸收紫外光和蓝光，发射绿光。通过更换GFP生色团氨基酸、插入内含子、改变碱基组成等基因工程操作，实现对GFP的改造，如增强其荧光强度和热稳定性、促进生色团的折叠、改善荧光特性等。 　GFP近年来发展出了多种突变体，通过引入各种点突变使发光基团的激发光谱和发射光谱均发生变化而发出不同颜色的荧光，有BFP，YFP，CFP等。这些突变体使GFP应用于FRET成为可能,为FRET技术用于活体检测蛋白质相互作用提供了良好的支持。;青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG和受体蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。 　如Tsien Miyaw