还原糖含量测定.pptVIP

实验六还原糖和总糖含量的测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 目的 通过本次实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉分光光度计的使用方法。 原理 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖。乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法，其基本原理是用比色法对还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS）共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线并计算，就可以分别求出样品中还原糖和总糖的含量。 管号 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS试剂(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 加热 同时一起在沸水浴中加热5min* 冷却 立即用流动冷水冷却至室温 蒸馏水(ml) 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 吸光值(A540) 操作步骤 1、绘制葡萄糖标准曲线 将以上各管上下颠倒几次使溶液混匀后，按顺序倒入比色杯中，在540nm波长条件下进行比色测定：用0号管溶液调零点，分别记录各管吸光值；然后以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制出标准曲线。 2、测定样品中还原糖和总糖含量。 （1）提取样品中的还原糖： 准确称取1g食用面粉放置于100ml三角瓶中，加少量蒸馏水调成糊状，再加入50ml蒸馏水，摇匀，置于50℃水浴条件下20分钟，使还原糖浸出；在4000rpm、5分钟条件下进行离心，得到的上清液倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，上下颠倒几次将溶液混匀，作为还原糖待测液。 （2）提取样品中的总糖： 准确称取0.1g食用面粉放置于100ml三角瓶中，加入10ml 6mol/L HCl及15ml蒸馏水，沸水浴30分钟（注意不能把水烧干）。用滴管吸取1~2滴水解液于白瓷板上，加1滴I-KI溶液，如显示出蓝色说明水解不完全，可适当延长沸水浴时间；若不显蓝色，则说明水解完全。 待水解液冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，用6mol/L NaOH中和至微红色，在4000rpm、5分钟条件下离心，得到的上清液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，上下颠倒几次混匀溶液，作为总糖待测液。 （3）显色和比色，按下表操作 管号 还原糖 总糖 样品量（ml） 2.0 1.0 蒸馏水（ml） 0 1.0 DNS试剂(ml) 1.5 1.5 加热 同时一起在沸水浴中加热5min* 冷却 立即用流动冷水冷却至室温 蒸馏水(ml) 21.5 21.5 吸光值(A540) 结果处理 以1、2号管的吸光值，分别在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数。按下列公式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量： 注意事项 1、标准曲线制作与样品含糖量测定应尽量同时进行，一起显色和比色。 2、实验过程中所有的试管要洁净，加入各种试剂量要准确。 3、试剂不可倒出试剂瓶，必须用干净的移液管吸取，用后盖好瓶塞，放回原处。 4、移液管使用：有色看外边缘，无色看中间凹处。 5、沸水浴：须等水沸腾后，才能将要加热的物品放入锅中；时刻注意锅内的水，防止烧干。 6、每组同学离开实验室时，必须经实验老师检查并同意后，方可离开。 7、值日生打扫干净实验室后，方可离开。 * *