多肽从头测序方法-精选课件(公开).pptVIP

多肽从头测序方法 安明瑞 2011年10月17日 主要内容 背景 多肽从头测序 我们改进的多肽从头测序方法及应用 总结 多肽测序方法 多肽质量指纹谱图 蛋白质在某种特定的酶（一般是胰蛋白酶）的酶切作用下，会形成一组多肽，而这一组多肽对应了一组分子量。不同蛋白质在酶切后会产生不同的一组多肽，对应不同的一组分子量。因此，可以通过质谱测得的一组分子量来确定究竟是什么蛋白。 缺点：遇到两种以上蛋白混合物或者分子量小于20 KD蛋白很难测定，并且严重依赖数据库。 Edman降解 将多肽或者蛋白的N-末端第一个氨基酸修饰上异硫氰酸苯酯，使之脱落并测定。重复该过程，可从N-末端依次得到多肽或蛋白的序列。 缺点：速度慢，成本高，测蛋白内部序列较麻烦。 质谱断裂 质谱断裂方法目前有两大类： CID Collision Induced Dissociation 碰撞诱导裂解 ETD（或ECD） Electron Transfer (Capture) Dissociation 电子转移（捕获）裂解 CID与ETD 多肽骨架上可能的碎裂位置 简化的二级谱图 正常的二级谱图 常规数据库检索的步骤 数据库检索结果 数据库检索的缺陷 是不能分析数据库里没有的多肽、蛋白包括以下几种情况： 1. 基因组未测序的非模式生物的蛋白 2. 数据库里没有的模式生物的蛋白突变体 3. 模式生物中由于信使RNA非特异性剪切或蛋白编辑产生 的未报到的蛋白 多肽从头测序的优、缺点 优点： 可以得到所有物种的多肽、蛋白序列，不论之前是否被报道过。 缺点： 可信度很低，因此没有被广泛使用 多肽从头测序策略可信度低的原因 1. 不同系列的离子叠加在二级质谱谱图上 原因：多肽碎裂时产生N-端与C-端两种系列的离子 2. 二级质谱谱图碎片离子信息不足 原因：多肽碎裂不完全，有的位置没有断裂 简化二级谱图的处理技术 1. 18O标记 2. 钠离子-多肽的多级质谱 3. 特殊蛋白酶的酶切 4. 时间延迟碎裂 5. 多肽N-末端衍生 18O标记 蛋白在16O与18O混合水中酶解时，产生的多肽C末端羧基有三种可能 -C16O16OH -C18O16OH -C18O18OH 因此，该肽段碎裂后，C-末端碎片离子的有更多的同位素峰，容易识别。 钠离子-多肽的多级质谱 多肽在电喷雾离子化过程如果结合的不是氢离子而是Na+离子，则CID条件下，其碎裂往往只发生在多肽C-末端最后一个氨基酸残基上。多次进行碎裂（多级质谱）则可以从C-末端依次测得其氨基酸残基。 特殊蛋白酶的酶切 使用Lys-N端酶酶切蛋白，产生的多肽其N-末端第一个氨基酸都是Lys。 例如：KSDEFQCCAG，KMPLLWDE等。 如果这些多肽不含有其他的碱性氨基酸（Arg或His），并且只带一个正电荷的话，那么这个正电荷在这个Lys上面。 在MALDI质谱上经过后源裂解（PSD）之后，电荷仍然只保留在N-末端的b离子上，而C-末端的y离子不带电，因此二级谱图上只有b离子。 时间延迟碎裂 多肽离子进入线性离子阱后，立即碎裂就会产生复杂的二级谱图（图A）。 如果停留10毫秒以上，一部分多肽离子内能会降低，这些内能降低的多肽碎裂产生的谱图往往只有y离子（图B）。 多肽N-末端衍生 负电荷衍生 在多肽N-末端引入一个磺酸基团，可以大大降低二级谱图中多肽N-末端碎片离子的信号强度，主要产生C-末端离子（如y离子）系列。 正电荷衍生 在多肽N-末端引入一个季铵或季膦基团，可以大大提高二级谱图中多肽N-末端碎片离子的信号强度，主要产生N-末端离子（如b离子）系列。 我们的研究目的 实现高可信度的多肽从头测序 1. 简化碎片离子系列（比如只产生单一的b离子） 2. 得到更完全的碎裂离子系列 改进的正电荷衍生及纯化工作流程 改进的衍生以及色谱分离效果 正电荷衍生前后CID谱图比较 ETD与CID的互补性 正电荷衍生多肽CID与ETD谱图 正电荷衍生多肽的CID与ETD谱图仍具有互补性。 ETD谱图融合到CID谱图中 大批量地从头测序 PEAKS软件 从头测序 利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，计算多肽序列 PEAKS 检索 是使用多肽序列到数据库中进行检索，而不是像常规数据库检索那样使用二级碎片离子信息。 PEAKS 检索及过滤 从头测序得到的多肽序列，经过PEAKS 检索及过滤，筛选获得高可信多肽（假阳性率1%） 为了评估上述使用正电荷衍生及谱图融合方法，我们对使用与不使用该方法所得到的高可信多肽的数量进行比较。 PEAKS 检索的结果 对检索未匹配多肽的分析 PEAKS 检索仍然使用了数据库，并受到数据的限制。