转录水平检测AFP.ppt

实验步骤及可能结果 实验原理 实验目的 原理：本制品利用反转录酶PrimeScript RTase将RNA反转录成cDNA，在以cDNA为模板利用TaKaRaEx Taq HS在同一反应管内连续进行RT-PCR扩增反应（利用SYBR GreenI嵌合荧光法）。采用如图所示的One Step RT-PCR方法，反转录以总RNA为模板，利用反应引物合成cDNA，在以此为模板，利用引物进行PCR扩增反应。 01 制品原理 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 应用生物信息学知识, 从基因库中查阅出AFP的DNA和mRNA序列。 根据引物设计原则, 并利用Primer Express 2.0设计软件, 设计出扩增AFP mRNA基因片段的上下游引物和探针。PCR实验成功的最关键环节就是引物的设计。 3 引物、探针的设计和合成 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 PPT课件 荧光定量RT-PCR 检测AFP mRNA 基因表达方法 * PPT课件 01 02 03 04 目录 CONTENT 实验 目的 实验 原理 实验步骤及可能结果 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 原发性肝细胞癌(HCC)严重威胁人类健康, 由于肝癌细胞容易侵犯血管, 易发生血行转移。 定量检测AFP m RNA 对于早期发现外周血的肝癌细胞、判断肝癌的复发转移、治疗效果及预后具有重要意义。 RT-PCR 是一种非常敏感的检测方法, 但无论竞争RT-PCR 还是内源性参比基因RT-PCR 定量法, 他们均属PCR 终点检测法, 在PCR扩增的指数期和平台期产量相差极大, 很难对起始模板数准确定量。 本实验运用荧光定量RT-PCR 技术建立了定量检测肝癌细胞AFP mRNA基因表达水平的方法。 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验步骤及可能结果 实验原理 实验目的 一、实时荧光定量PCR（FQ-PCR） 01 荧光染料 02 荧光共振能量转移 03 PCR扩增及其监测 04 实时荧光定量PCR定量原理 05 实时荧光定量PCR优缺点 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验步骤及可能结果 实验原理 实验目的 荧光基团通常各有单一的的光吸收峰，荧光基团吸收激发光的能量后通常以3种方式释放出能量。 （1）光能 （2）热能 （3） 转移给邻近的分子 01 荧光染料 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验步骤及可能结果 实验原理 实验目的 当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽（猝灭）。 02 荧光共振能量转移 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验步骤及可能结果 实验原理 实验目的 荧光PCR的独特之处在于PCR过程中利用荧光染料在激发光下释放的荧光能量的变化直接反应PCR扩增产物量的变化。由于荧光信号变量与扩增产物变量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器对荧光进行采集和分析，能够实现对PCR过程的检测，达到对原始模板定量的目的，主要采用以下数种模式： 03 PCR扩增及其监测 01 仿溴乙錠着色监测 02 荧光标记引物 03 荧光标记探针 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验步骤及可能结果 实验原理 实验目的 荧光染料（如SYBR Green I）直接嵌入扩增产物DNA双股螺旋链中，通过对特定方向的强荧光检测或的信号。这种模式能特异性地区分单链、双链DNA（只与双链DNA结合），缺点是已产生非特异信号，且本底较高。 03 PCR扩增及其监测 01 仿溴乙錠着色监测 荧光定量RT-PCR应用 * PPT课件 实验步骤及可能结果 实验原理 实验目的 04 实时荧光定量PCR定量原理 1.几个基本概念 01 02 0