化学生物学化学物质与蛋白质的相互作用.pptxVIP

第一节 化学物质对蛋白质的沉淀作用一、沉淀作用的类型等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法 1．可逆沉淀(非变性沉淀 )条件温和结构和性质不变化 分离和纯化蛋白质的基本方法具有部分纯化、浓缩特点一、沉淀作用的类型加热沉淀 强酸碱沉淀 重金属盐沉淀 2．不可逆沉淀（变性沉淀 ）强烈沉淀条件 破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性 破坏了蛋白质的结构和性质 3．抗体-抗原沉淀二、沉淀剂的类型1．无机物沉淀（1）盐析 lgS=lgS0-KsI盐析方程 So代表当离子强度为零时的溶解度；S为蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度；I为中性盐的离子强度；Ks为盐析常数，Ks值越大，该盐的盐析效果较好 阴离子对蛋白质盐析影响较显著，而阳离子影响次之。含高价阴离子的盐，效果比1价的盐好 阴离子的盐析效果 枸橡酸盐 PO43- SO42-CHCOO-Cl-NO3-SCN-高价阳离子的效果不如低价阳离子 NH4+ K+ Na+对于1价阳离子： 最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠 （2）金属离子沉淀法 ① Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+ 与蛋白质分子表面的羧基、氨基、咪唑基、胍基等侧链结合 ② Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+ 与蛋白质分子表面的羧基结合，但不与含氮化合物相结合 ③ Ag2+、Hg2+与蛋白质分子表面的巯基相结合 2．等电点沉淀适用于疏水性较强的蛋白质 优点：（1）很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常较廉价；（2）某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许；（3）常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。 缺点： 酸化时易使蛋白质失活 3．有机物沉淀（1）有机溶剂 主要效应是水活度的降低 优点：溶剂易蒸发除去，无残留 用途：适用于制备食品蛋白质 缺点：易使蛋白质变性失活， 且有机溶剂易燃、易爆，安全要求较高 最常用的溶剂是乙醇和丙酮 （2）酚类化合物及有机酸沉淀 鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即2，4，6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸 水解类单宁 缩合类单宁 单宁-蛋白质结合是分子识别的典型例子。要考虑作为供体的多酚和作为受体的蛋白质的分子组成、结构和构型，也要考虑它们的协同作用。Haslam等认为，可用“手-手套”(Hand-in-Glove)模型说明此反应。蛋白质分子中疏水基团较集中的部位构成“疏水袋”，单宁分子进入“疏水袋”中并通过氢键加强结合。因此影响单宁与蛋白质结合的因素有：单宁的分子尺寸，分子量大于500时产生较牢固的结合；单宁的酚羟基和疏水基数量多者结合强；具有柔性的分子构型者结合强；水溶性低者结合强。因此水解单宁的收敛性与其所含疏水基多少有直接的关系，缩合单宁则与其聚合程度有关，往往前者的收敛性大于后者。 4．聚合物沉淀（1）非离子型聚合物沉淀法 聚乙二醇（PEG） （2）聚电解质沉淀法 羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐和卡拉胶 聚丙烯酸 第二节 化学物质对蛋白质的稳定作用蛋白质变性： 某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失的现象蛋白质不可逆失活的化学因素 强酸和强碱 氧化剂：分子氧、H2O2、过氧化物(如过氧甲酸)、氧自由基 去污剂和表面活性剂 ：十二烷基硫酸钠（SDS ）变性剂：8~10mol/L脲、 6 mol/L盐酸胍、有机溶剂 、EDTA重金属离子和巯基试剂：Hg2＋、Cd2＋、Pb2＋、巯基乙醇 使蛋白质稳定的化学方法（1）固定化（2）添加剂（3）化学修饰共溶剂 抗氧化剂和还原剂底物、辅酶金属离子第三节化学物质对蛋白质侧链基团的共价修饰作用一、生物体内蛋白质加合物的形成非共价结合相互作用方式 共价结合不可逆 1．可与蛋白质发生反应的化合物2．蛋白质分子中的可反应基团组氨酸的咪唑基酪氨酸中的酚基色氨酸的吲哚基氨基酸的氨基和羧基丝氨酸和苏氨酸所特有的羟基半胱氨酸的巯基精氨酸的胍基3．与白蛋白的共价结合4．与血红蛋白共价结合5．与细胞内蛋白共价结合二、特定的氨基酸残基侧链基团的修饰蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反应而实现的 作用：探测活性部位的结构 选择好的修饰试剂判断必需基团的性质和数目 1．巯基的化学修饰烷基化试剂（碘乙酸、碘乙酰胺 ） 多肽链氨基酸顺序分析过程中防止半胱氨酸的氧化 N-乙基马来酰亚胺 有较强专一性和光吸收的变化，易于确定反应程度 5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB） 有机汞试剂（对氯汞苯甲酸 ） 溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时在255nm处光吸收具有较大的增强效应 2．氨基的化学修饰非质子化赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团 三硝基苯磺酸（TNBS）与赖