狂犬病病毒中和抗体检测快速荧光灶抑制试验的建立.docVIP

中国卫生检验杂志2010年2月第20卷第2期　Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20　No 2439 【经验交流】 狂犬病病毒中和抗体检测快速荧光灶抑制试验的建立 吕新军, 唐青, Herv éBourhy , 马学军 1 1 2 13 (11中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京　100052; 21Pasteur I nstitute Paris, 75724 [关键词]　狂犬病病毒; 中和抗体; 快速荧光灶抑制试验 [中图分类号]　R183. 9　　　　[文献标识码]　C 　　　　[文章编号]　1004-8685(2010 02-0439-03 　　RFF I T 是WHO 推荐的检测狂犬病病毒中和抗体的标准 实验方法[1], 美国疾病预防控制中心狂犬病实验室、法国巴斯德研究所狂犬病实验室等国际知名狂犬病研究机构都采用该方法进行狂犬病病毒中和抗体检测, 保护水平的中和抗体效价应≥015I U /ml 。RFF I T 主要应用于狂犬病疫苗的免疫学效 [2, 3] 果评估和狂犬病病毒中和抗体替代检测试剂和方法的评[4, 5]估, 是狂犬病疫苗及中和抗体诊断试剂评价的关键技术。 近5年来我国每年因狂犬病死亡2500～3500人[6], 仅次于印度位居全球第二。面对国内严峻的狂犬病疫情, 国家卫生职能部门强化了狂犬病的免疫预防措施, 一些大型狂犬病免疫干预项目逐步具备实施条件, 国内狂犬病病毒中和抗体检测需求快速增长, 在我国疾病预防控制体系内建立RFF I T 十分必要。 RFF I T , 推广应用的主要障碍先建立了RFF I T 检测体系, 为狂犬病疫苗大量应用的免疫学检测和监测提供了可靠的技术支持。 1　材料与方法 111　病毒、细胞系和标准血清 113　待测样品 编号为CL 、HY 、JY 、DJL 、WXG 、T L 的6份待测血清来自本 实验室健康研究人员, 均具有完整和清晰的背景资料, 其中编号为T L 的研究人员从未接受过狂犬病疫苗免疫, 其血清作为阴性对照血清, 另外5人接受过狂犬病疫苗暴露前免疫, 其血清作为待测阳性血清。114　细胞悬液的制备 25c m 方瓶培养的BSR 细胞铺满单层后倒掉培养液, 0125%胰酶液和0102%Versene 液1:3混合作为消化液, 以2m l 消化液洗涤细胞2次, 加入2m l 消化液消化, 当细胞开始 2 , 5m l DM E M 培养液, , 1, 根据计数结果补加 6 E 养到1×10细胞/ml 。每个 25c m 1m l 上述细胞悬液, 用10%F BS 的DM E M 7m l 于37℃5%C O 2孵箱孵育72～96h 。115　病毒种子的制备 25c m 方瓶需上述细胞悬液1m l, 其它规格的方瓶所需细胞悬液体积以此类推。按照感染指数(MO I 为011计算所需 2 已知病毒滴度的C VS -11上清的体积, 将CVS -11上清加入方瓶内混合均匀, 37℃5%C O 2孵箱孵育1h, 期间每5～10m in 摇匀1次, 补足10%F BS 的DME M 培养液, 37℃5%C O 2孵箱孵育72h, 收获病毒上清, 测定病毒滴度, 大于 10FF U /ml 可以使用。连续感染3代细胞, 每代收获的病毒 6 已知病毒滴度的狂犬病病毒标准攻击毒株CVS -11上清和BSR 细胞系由本实验室保存, 30I U /ml 标准血清冻干品由英国国立生物制品和控制标准品研究所提供。112　试剂和仪器 DME M 培养液购自Gibico 公司, 胎牛血清(Fetal Seru m of Bovine, F BS 购自四季清生物制品有限公司, 100U /ml 青霉素和链霉素双抗混和液、0125%胰酶液、0102%Versene液由本所配液室提供, 抗狂犬病病毒核蛋白荧光抗体购自M illi pore 公司。普通倒置光学显微镜为OLY M P US CX41型, 正置荧光显微镜为OLY MP US I X51型。 [基金项目]　十一五科技重大专项-传染病检测技术研究-传 染病病原体诊断和组合检测技术(2008ZX10004-002 ; 中美新发和再发传染病合作项目(2007-2008I D :9141211-2 ; 法国赛诺菲-巴斯德公司 中国大陆学者赴法培训资助项目(2008年度 [作者简介]　吕新军(1973- , 男, 医学博士, 副研究员, 主要从 事病毒病预防控制工作。 3通讯联系人, E -mail:maxj2004@yahoo1com 1cn 上清按照015m l/管分装, -70℃冰箱保存, 分别作为第1、2、3 代病毒种子。116　病毒种